《中國藥典》2015年版微生物基本知識解析

1、微生物檢查體系的調(diào)整,微生物檢測環(huán)境變化,控制菌項目變化,,《非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法》,通用要求要點：(1) 微生物計數(shù)法系用于能在有氧條件下生長的嗜溫細(xì)菌和真菌的計數(shù)。 本檢查法可采用替代檢查方法，包括自動檢測法，但必須證明其替代方法等效于藥典規(guī)定的檢查方法。（9201）藥品微生物檢驗替代方法驗證指導(dǎo)原則(2) 環(huán)境潔凈度應(yīng)符合要求。定期檢測：不低于B級的單向流空氣區(qū)域、工作臺面、環(huán)境。參考USP〈1117〉實驗室

2、分區(qū)原則。(3) 前處理：供試品的抗菌活性，中和劑和滅活劑的有效性及無毒性。表面活性劑的無毒性及與相容性。(4) 方法選擇：根據(jù)供試品理化特性和微生物限度標(biāo)準(zhǔn)等因素選擇。（平皿法、薄膜過濾法和MPN法）(5) 菌種管理：（9203）藥品微生物實驗室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則關(guān)于菌株管理的要求。(6) 陰性對照：微生物檢查需進行陰性對照試驗。如果對照有菌生長，應(yīng)進行偏差調(diào)查。,試驗菌,微生物計數(shù)用培養(yǎng)基,培養(yǎng)基適用性檢查,,,培養(yǎng)基適用性檢

3、查,,計數(shù)方法適用性試驗,2、接種和稀釋,接種和稀釋,消除供試品的抑菌活性的方法（1）增加稀釋劑和培養(yǎng)基的用量；（2）加入中和劑或滅活劑；（3）采用薄膜過濾法和沖洗；（4）綜合上述措施。 ●根據(jù)供試品須符合的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)和菌數(shù)報告規(guī)則，在不影響檢驗結(jié)果判斷的前提下，應(yīng)采用能使微生物生長的更高稀釋級的供試液進行方法適用性試驗。若方法適用性試驗符合要求，應(yīng)以該稀釋級供試液作為最低稀釋級的供試液進行供試品檢測。,培養(yǎng)條件

4、,結(jié)果判斷,供試品檢查部分 1、操作,,供試品檢查部分 2、培養(yǎng),供試品檢查部分-結(jié)果判斷,供試品檢查部分-結(jié)果判斷,供試品檢查部分-計數(shù)標(biāo)準(zhǔn),,《非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法》,通用要求要點：(1)控制菌檢查法系用于在規(guī)定的試驗條件下，檢查供試品中是否存在特定的微生物。本檢查法可采用替代檢查方法，包括自動檢測法，但必須證明其替代方法等效于藥典規(guī)定的檢查方法。（9201）藥品微生物檢驗替代方法驗證指導(dǎo)原則。(2)供

5、試液制備及實驗環(huán)境要求同《非無菌產(chǎn)品微生物檢查：微生物計數(shù)法》參考USP〈1117〉實驗室分區(qū)原則。(3)前處理：供試品的抗菌活性，中和劑和滅活劑的有效性及無毒性。表面活性劑的無毒性及與相容性。(4)在各控制菌項下：生化實驗和“應(yīng)進行分離、純化及適宜的鑒定實驗。”改為較少的生化實驗或“采用其它適宜方法進一步鑒定。”,控制菌結(jié)果判斷趨向多樣化,? 控制菌檢查中將原來大腸菌群的檢測改為耐膽鹽的革蘭氏陰性菌，另外培養(yǎng)基體系也有較明顯的

6、變化，較少的生化實驗或采用其它適宜方法進一步鑒定（鏡檢、生化、色譜光譜技術(shù)、分子生物學(xué)等）,供試品檢查部分-耐膽鹽革蘭陰性菌,大腸菌群的定義是指在37℃生長時能發(fā)酵乳糖，24h內(nèi)產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭陰性、氧化酶陰性、需氧或兼性厭氧的無芽孢桿菌。它不是分類學(xué)上的名稱。符合上述定義的菌除埃希菌屬外，還包括腸桿菌科的腸桿菌屬、枸櫞酸菌屬、克雷伯菌屬。,供試品檢查部分-耐膽鹽革蘭陰性菌,取供試品，用胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基作為稀釋劑照“非無菌產(chǎn)品微生物限

7、度檢查：微生物計數(shù)法”（通則1105）制成1:10供試液，混勻，在20~25 ℃培養(yǎng)，培養(yǎng)時間應(yīng)使供試品中的細(xì)菌充分恢復(fù)但不繁殖（約2小時）。取相當(dāng)于1g或1ml供試品的上述預(yù)培養(yǎng)物接種至適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗確定）腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，30~35 ℃培養(yǎng)24~48小時后，劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板上，30~35 ℃培養(yǎng)18~24小時。如果平板上無菌落生長，判供試品未檢出耐膽鹽革蘭陰性菌。1:10TSB供試液（20-

8、25 ℃ 2h）腸道增菌肉湯 → 紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂（大腸、銅綠+/金葡-） （大腸、銅綠+＆指示）24-48h 18-24h,供試品檢查部分-耐膽鹽革蘭陰性菌,選擇和分離培養(yǎng) 取相當(dāng)于0.1g、0.01g和0.001g(或0.1ml、0.01ml和0.001ml）供試品的預(yù)培養(yǎng)物或其稀釋液分別接種至適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗確定）

9、腸道增菌液體培養(yǎng)基中，30~35℃培養(yǎng)24~48h。上述每一培養(yǎng)物分別劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，30~35 ℃培養(yǎng)18~24h。結(jié)果判斷 若紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長，則對應(yīng)培養(yǎng)管為陽性，否則為陰性。根據(jù)各培養(yǎng)管檢查結(jié)果，從表二查對1g或1ml供試品中含有耐膽鹽革蘭陰性菌的可能菌數(shù)。表2 耐膽鹽革蘭陰性菌的可能菌數(shù)（N）--------------------------------

10、-------------------------------------------------------------------------------------------- 各供試品量的檢查結(jié)果 --------------------------------------------------------每1g（或1ml）供試品種可能的菌數(shù)cfu

11、 0.1g或0.1ml 0.01g或 0.001g或 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- +

12、 + + N >103 + + - 102 < N< 103

13、 + - - 10<N<102 - - -

14、 N <10 --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------,供試品檢查部分-大腸埃希菌,大腸埃希菌室腸桿菌科埃希菌屬的代表種大腸埃希菌室兩端鈍圓的短小直桿菌，單

15、個或成對，格蘭陰性。無芽孢，多鞭毛，培養(yǎng)最適溫度為37 ℃ ，可在15~46 ℃生長，兼性厭氧。 取1:10供試液至tsb（適宜體積）（18-24h） MaC肉湯 → MaC瓊脂 （大腸+/金葡-） （大腸+＆指示） 42-44 ℃ 24-48h 18-72h結(jié)果判斷 若麥康凱瓊脂培

16、養(yǎng)基平板上有菌落生長，應(yīng)進行分離、純化及適宜的鑒定試驗，確證是否為大腸埃希菌；若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結(jié)果為陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌。,供試品檢查部分-沙門菌,沙門菌為革蘭陰性菌，無芽孢，菌體通常（0.4~0.9）um×（1~3）um，兩端鈍圓。需氧或兼性厭氧，10~42℃皆可生長，最適溫度37 ℃. 加入10g供試品的TSB供試液（18-24h)

17、 RV肉湯 → XLD瓊脂 （沙門+/金葡-) (沙門+/金葡-） 18-24h 18-48h結(jié)果判斷 若木糖賴氨酸脫氧但酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上有疑似菌落生長，且三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基的斜面為紅色、底面為黃色，或斜面黃色、

18、底層黃色或黑色，應(yīng)進一步進行適宜的鑒定試驗，確證是否為沙門菌。若果平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結(jié)果為陰性，或三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基的斜面未見紅色、底層未見黃色；或斜面黃色、底層未見黃色黑色，判供試品未檢出沙門菌。,《非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：非無菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)》,表1 非無菌化學(xué)藥品制劑、生物制品制劑、不含藥材原粉的中藥制劑微生物限度標(biāo)準(zhǔn),《非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：非無菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)》,表2 非無菌含藥材

19、原粉的中藥制劑微生物限度標(biāo)準(zhǔn),《非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：非無菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)》,表3 非無菌的藥用原料及輔料微生物限度標(biāo)準(zhǔn)（新增）表4 中藥提取物及中藥飲片的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)（新增）,非無菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn),限度標(biāo)準(zhǔn)由“數(shù)量”向“數(shù)量級”轉(zhuǎn)變 非無菌藥品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)照“非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法”（通則1105）檢查；非無菌藥品的控制菌照“非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌

20、檢查法”（通則1106）檢查。各品種項下規(guī)定的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)解釋如下： 101 cfu: 可接受的最大菌數(shù)為20; 102 cfu: 可接受的最大菌數(shù)為200; 103 cfu: 可接受的最大菌數(shù)為2000:以此類推。 雖然擴大了限度的

21、標(biāo)準(zhǔn)，但是對過程控制的要求有了很大的提高，培養(yǎng)基的營養(yǎng)能力也有了很多的提高，未來將向參數(shù)放行方向發(fā)展。,1101 無菌檢查法-培養(yǎng)基,硫乙醇鹽酸流體培養(yǎng)基主要用于厭氧菌的培養(yǎng)，也可用于需氧菌培養(yǎng)；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基用于真菌和需氧菌的培養(yǎng)。,培養(yǎng)基體系與國際接軌，改變以往微生物分類培養(yǎng)的錯誤，正確考慮培養(yǎng)基的廣譜性。否定了檢查中對微生物分類培養(yǎng)的概念，即某種污染了需氧菌的供試品，無論被接種在TSB中，均可被檢出，不容易漏檢。,1101

22、 無菌檢查法-培養(yǎng)基的適用性檢查,本檢查可在供試品的無菌檢查前或與供試品的無菌檢查同時進行。1、無菌性檢查 每批培養(yǎng)基隨機取不少于五支（瓶），置各培養(yǎng)基規(guī)定的溫度培養(yǎng)14天，應(yīng)無菌生長。2、靈敏度檢查---培養(yǎng)基靈敏度檢查所用菌株傳代次數(shù)不得超過5代。,將枯草芽孢桿菌移到TSB靈敏度檢查中，能夠確保在兩種培養(yǎng)基中需氣菌都能夠生長,1101 無菌檢查法-培養(yǎng)基靈敏度檢查,12ml的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基7支，分別接種小于

23、100cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌各2支，另1支不接種作為空白對照，培養(yǎng)3天。9ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基7支，分別接種小于100cfu的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接種作為空白對照，培養(yǎng)5天。對照管無菌生長，若加菌的培養(yǎng)基管生長良好，判該培養(yǎng)基的靈敏度檢查符合規(guī)定。,1101 無菌檢查法-方法適用性試驗,藥典規(guī)定 進行產(chǎn)品無菌檢查時，應(yīng)進行方法適用性檢驗，以確認(rèn)所采用的方法適合于

24、該產(chǎn)品的無菌檢查。 若檢驗程序或產(chǎn)品發(fā)生變化可能影響檢驗結(jié)果時，應(yīng)重新進行方法適用性試驗。,選用菌株的原則 代表性 普遍性 低或非致病性 標(biāo)準(zhǔn)菌株（或藥品中常見的污染菌）試驗方法：薄膜過濾法和直接接種法?？膳c供試品的無菌檢查同時進行。,1101 無菌檢查法-供試品無菌檢查,無菌檢查法包括薄膜過濾法和直接接種法。只要供試品允許，應(yīng)采用薄膜過濾法。供試品檢查方法應(yīng)與方法適用性確認(rèn)的方法相同。若是表面活性劑、滅活

25、劑、中和劑等試劑，應(yīng)證明其有效性，且對微生物無毒性。 檢驗數(shù)量及檢驗量,表1、表2中最少檢驗數(shù)量不包括陽性對照試驗的供試品用量,1101 無菌檢查法-檢驗量,表1：針對注冊性質(zhì) 表2、針對委托、進口、國評等性質(zhì) 具體檢驗量要看檢品的裝量來綜合三個表：如果是注冊的則看表1和表3，若果是其他的則看表2和表3例1：

26、注射用頭孢呋辛鈉，規(guī)格0.25g，注冊查表1得 批產(chǎn)量：﹥500，接種每種培養(yǎng)基所需的最少檢驗數(shù)量：2﹪或20個（取較少者，目前我們都是取20個）查表3得 每支供試品接入每種培養(yǎng)基的最少量：半量（即一瓶樣品可以對半接種至每種培養(yǎng)基）綜上述得：取30瓶樣品，分三份接種至每種培養(yǎng)基里面。例2：注射用宮縮素，規(guī)格10單位，注冊查表1得 批產(chǎn)量：﹥500，接種每種培養(yǎng)基所需的最少檢驗數(shù)量：2﹪或20個（取較

27、少者，目前我們都是取20個）查表3得 每支供試品接入每種培養(yǎng)基的最少量：全量綜上述得：取60瓶樣品，分三份接種至每種培養(yǎng)基里面。例3： 左卡尼汀注射液，規(guī)格5ml：1g左卡尼汀，進口查表2得 供試品最少檢查數(shù)量（瓶或支）：10支查表3得 每支供試品接入每種培養(yǎng)基的最少量：半量綜上述得：取15支樣品，分三份接種至每種培養(yǎng)基里面。,1101 無菌檢查法-供試品無菌檢查,陽性對照試驗無抑制作

28、用的供試品以金色葡萄球菌為對照菌；抗革蘭陽性為主的供試品，以金黃色葡萄球菌為對照菌；抗革蘭陰性為主的供試品以大腸埃希菌為對照菌；抗氧菌的供試品，以生孢梭菌為對照菌；抗真菌的供試品，以白色念珠菌為對照菌。陰性對照試驗 供試品無菌檢查時，應(yīng)取相應(yīng)溶劑和稀釋液、沖洗液同法操作，作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。,1101 無菌檢查法-供試品無菌檢查-薄膜過濾法,操作方法:將規(guī)定量的供試品溶液按薄膜過濾法過濾，沖洗

29、（按適應(yīng)性試驗確認(rèn)的方法）。將培養(yǎng)基加至濾筒內(nèi)檢查要點：采用封閉式包，薄膜過濾器。濾膜孔徑應(yīng)不大于0.45um。根據(jù)供試品特性選擇濾膜材質(zhì)。濾過過程保持液面覆蓋整張膜。每膜總沖洗量不得過1000ml。,1101 無菌檢查法-供試品無菌檢查-培養(yǎng)及觀察,1101 無菌檢查法-結(jié)果判斷,陽性對照管應(yīng)生長良好，陰性隨著管無菌生長。若供試品管均澄清，或雖顯渾濁但經(jīng)確證無菌生長，判供試品符合規(guī)定；若供試品管中任何一管顯渾濁并確證有菌生長，判