細(xì)菌質(zhì)量控制

1、臨床細(xì)菌學(xué)質(zhì)量控制曲月英,黑龍江省臨床檢驗中心,細(xì)菌質(zhì)控分為室內(nèi)質(zhì)控室間質(zhì)評兩部分,,室內(nèi)質(zhì)量控制,臨床細(xì)菌學(xué)室內(nèi)質(zhì)控工作是細(xì)菌檢驗工作中心。是隨臨床檢測同步進行的一項常規(guī)工作；是臨床檢測工作的一項重要組成部分。它貫穿于實驗室所有的工作環(huán)節(jié)和每一個檢測項目。室內(nèi)質(zhì)量控制工作可使檢測結(jié)果的重現(xiàn)性得到最大限度的保證，同時還可及時發(fā)現(xiàn)實驗中存在的問題，如操作程序或手法、實際質(zhì)量、環(huán)境溫度等方面的問題。盡量減少并檢測由這問題造成的結(jié)果偶

2、然性偏差。 3,室內(nèi)質(zhì)量控制,由于室內(nèi)質(zhì)量控制是臨床實驗室天天都要進行的一項工作，所以持之以恒是非常重要的。除此之外，嚴(yán)格執(zhí)行室內(nèi)質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)操作程序亦非常重要。切忌將室內(nèi)質(zhì)量控制流于形式。 4,,由于檢驗醫(yī)學(xué)各專業(yè)所

3、采用的方法學(xué)不盡相同，使得室內(nèi)質(zhì)質(zhì)量控制的方法亦各具特點。臨床細(xì)菌學(xué)與其他專業(yè)相比，室內(nèi)質(zhì)量控制工作特點顯得較為突出，主要表現(xiàn)為繁鎖、個別環(huán)節(jié)不易操作.主觀解釋也比較多，各步驟間是密切聯(lián)系的。一旦某一環(huán)節(jié)出現(xiàn)差錯，就會直接影響最終結(jié)果及臨床治療.所以必須做好此項工作. 5,室內(nèi)質(zhì)控包括以下幾個方面：,（一）實驗室前的質(zhì)量控制 實驗室前的質(zhì)量控制是所有實驗室內(nèi)質(zhì)量

4、控制之根本，主要包括標(biāo)本的采集、運送和采集的時間。由于臨床對細(xì)菌檢驗知識或?qū)?xì)菌學(xué)不太了解。對標(biāo)本的采集、采集時間、采集量及運送方式不得法，使細(xì)菌檢驗常常失敗或發(fā)生錯誤。不論細(xì)菌室工作人員有多豐富的細(xì)菌診斷知識及經(jīng)驗、如何努力、設(shè)備如何完善， 如果標(biāo)本采集、時間、方法、采集量及運送方法等任何一項有差錯，也得不準(zhǔn)確的結(jié)果。 6,,所以需要臨床細(xì)菌室制定標(biāo)本采

5、集指南。讓臨床知道和了解細(xì)菌標(biāo)本采集的要求。其中包括各種標(biāo)本采集時間、采集方法、采集量及運送方法。如尿和痰標(biāo)本需要清晨采取；而血標(biāo)本則需要根據(jù)不同目的或在發(fā)燒初期或發(fā)燒高峰期間采??；咽喉潰瘍的涂片與培養(yǎng)時，須小心的從真正潰瘍處采取標(biāo)本，不要受到口腔分泌物的污染；皮膚或下表皮的擴散性感染，應(yīng)采集病灶處的邊緣，而非中央處的感染組織送檢。

6、 7,,采集標(biāo)本時應(yīng)遵循無菌采樣，避免污染，特別是對血液、腦脊液等無菌體液標(biāo)本在采集時。要嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作，嚴(yán)禁污染。采集要“足量”不得過少，且有代表性，否則影響細(xì)菌檢驗.如采集膿標(biāo)本，最好采集數(shù)毫升；血培養(yǎng)應(yīng)采抗凝血5ml (成人)幼兒不得少于1-2 ml；用棉拭子采集標(biāo)本時，必須多采取幾根拭子.標(biāo)本采集后

7、要迅速送檢避免保存過長時間.過長保存，會使雜菌生長起來，湮沒致病菌的生長；也有可能使致病死亡。如尿液放置過長會長雜菌，痰和糞便放置過長，會使細(xì)菌死亡。不能立即送檢的標(biāo)本應(yīng)作相應(yīng)處理.所有病原學(xué)標(biāo)本應(yīng)在應(yīng)用抗生素之前作培養(yǎng). 8,（二）標(biāo)本接種培養(yǎng)前的質(zhì)量控制,標(biāo)本接種前必須首先檢查是否合格。外觀檢查：如痰標(biāo)本的肉眼觀察：觀察顏色、粘度、有無血絲或膿。

8、若標(biāo)本為水狀且很明顯是唾液，則為不合格標(biāo)本。鏡檢：如尿標(biāo)本，用未離心的新鮮尿液在高倍鏡檢中，每視野白細(xì)胞大于或等于10個（≥ 10個∕HPF）即說所謂膿尿，為合格標(biāo)本。 9,直接涂片檢查,其目的是：及時發(fā)現(xiàn)標(biāo)本中存在的微生物，選擇適宜的培養(yǎng)基進行病原學(xué)的分離鑒定。如痰標(biāo)本應(yīng)作涂片檢查，根據(jù)鱗狀上皮細(xì)胞，柱狀上皮細(xì)胞和白細(xì)胞的量判斷標(biāo)本采集是否合格。若鱗狀上皮細(xì)胞數(shù) >25個/LHP時，表示標(biāo)

9、本受到口腔分泌液嚴(yán)重污染。如每低倍視野鱗狀上皮細(xì)胞25個（WBC>25個/LHP ）為合格標(biāo)本。 10,,臨床醫(yī)生一般認(rèn)為優(yōu)勢菌具有臨床意義， 革蘭染色的涂片中如何判定優(yōu)勢菌很重要，一般說，在油鏡下，優(yōu)勢菌在10個視野內(nèi)出現(xiàn)的頻率至少要達到50%。不合格的標(biāo)本應(yīng)要求臨床重新采集后送檢。

10、 11,(三)分離培養(yǎng)的質(zhì)量控制,標(biāo)本中病原菌的分離率受多種因素的影響，如標(biāo)本采集因素、分離培養(yǎng)基的質(zhì)量和是否及時接種。臨床上苛養(yǎng)菌檢出率很低，其中一個重要原因是國產(chǎn)培養(yǎng)基質(zhì)量問題，在一個就是細(xì)菌室技術(shù)水平和人員素質(zhì)問題。如果一個細(xì)菌室分離不出可養(yǎng)菌，就不可能反映出細(xì)菌分布的特點，也不能滿足臨床的需要。此外他又是衡量一個細(xì)菌室技術(shù)水平和人員素質(zhì)的重要標(biāo)志。臨床細(xì)菌室應(yīng)建立細(xì)菌標(biāo)本隨時接種制度，尤其是某些苛養(yǎng)菌的分離

11、，否則將嚴(yán)重影響 分離率. 12,（四）培養(yǎng)基的質(zhì)量控制,培養(yǎng)基的質(zhì)量控制主要分為六個部分，包括原材料、分離培養(yǎng)基、選擇性培養(yǎng)基、鑒定培養(yǎng)基、PH測試，無菌試驗1、原材料 各種培養(yǎng)基的原材料進入實驗室之日就應(yīng)作記錄，記錄中應(yīng)包括批號、日期、品名、廠家和開始使用的日期.每次使用也應(yīng)記錄配置量和操作者姓名.

12、 13,分離培養(yǎng)基,對分離培養(yǎng)的培養(yǎng)基質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)包括菌落形態(tài)、大小、溶血特性。用流感嗜血桿菌來測試巧克力瓊脂的分離能力(16—18小時生長)，用肺炎鏈球菌測試血瓊脂的分離能力（中等菌落 α-溶血）并根據(jù)不同培養(yǎng)目的配置選擇性巧克力培養(yǎng)基。 14,選擇性培養(yǎng)基,對選擇性培養(yǎng)基要看被抑制菌和被選擇菌生長的狀態(tài).用大腸桿菌、痢疾桿菌

13、和金黃色葡萄球菌，來測試選擇性培養(yǎng)基的選擇性.如在中國蘭培養(yǎng)基上，大腸桿菌（蘭色菌落）和痢疾桿菌（無色菌落）可以生上，但金黃色葡萄球菌不應(yīng)生長。在ss培養(yǎng)上痢疾桿菌生長（無色菌落），大腸桿菌少量生長（菌落粉紅色，周圍有沉淀），金黃色葡萄球菌不應(yīng)生長. 15,鑒定培養(yǎng)基,主要是用以觀察細(xì)菌是否具備某種生物化學(xué)反

14、應(yīng)能力。不管是自制或商品購入的鑒定培養(yǎng)基，都要進行質(zhì)量檢測。均應(yīng)用相應(yīng)陽性反應(yīng)和陰性反應(yīng)的菌株進行測試。符合標(biāo)準(zhǔn)方可使用。 pH測試，如果使用商品化脫水培養(yǎng)基，嚴(yán)格按照說明操作，一般不必再進行pH測試。如果使用基礎(chǔ)物質(zhì)進行培養(yǎng)基制備，在培養(yǎng)基冷卻后須進行pH測試. 16,,如果pH測得值與預(yù)期值.相差0.2單位，則需要酸堿調(diào)解.無菌試驗 一般為隨機抽樣3-5%，在35℃條件下培養(yǎng)48小時

15、.如果抽樣中每個培養(yǎng)基上出現(xiàn)2個以上菌落，證明本批培養(yǎng)基已被污染.所有培養(yǎng)基都要進行外觀檢查（透明度、色澤）.性能檢測.要求用已知特性穩(wěn)定的質(zhì)控菌株進行鑒定.用于質(zhì)量控制的菌株應(yīng)固定做妥善保存. 17,（五）常用儀器的質(zhì)量控制,實驗室儀器設(shè)備是我們從事臨床標(biāo)本檢測的工具。因此，儀器設(shè)備的質(zhì)量維護對保證檢測質(zhì)量至關(guān)重要。

16、 18,表1臨床細(xì)菌學(xué)實驗常用儀器設(shè)備的質(zhì)量維護,儀器名稱 質(zhì)量維護說明 全面技術(shù)檢查 顯微鏡 每次工作結(jié)束后，用

17、鏡頭紙擦拭并清潔鏡頭 至少每年一次 妥善放置避免振動、潮濕及灰塵 至少每月檢查一次聚光器 高壓滅菌器   至少每月清潔一次內(nèi)室

18、 至少6個月一次 每次使用時應(yīng)有專人負(fù)責(zé) 每次使用時均應(yīng)動態(tài)記錄溫度及壓力 每次使用時均應(yīng)按疾病控制中心的要求進行鑒測恒溫孵育箱 至少每月清潔一次內(nèi)室

19、 至少6個月一次 設(shè)定符合要求的溫度控制范圍，保證每日至少進行一次溫度鑒測并記錄 天平 保持天平及砝碼的清潔、干燥

20、 按照計量部門要求 妥善放置、避免振動及潮濕 該工作區(qū)內(nèi)盡量避免空氣流動 稱量時使用稱量紙，避免被稱量物直接接觸托盤冰箱

21、 在距墻至少25cm處放置 至少每年一次 至少每兩個月清理一次內(nèi)室（包括除霜、除冰） 設(shè)定符合要求的溫度控制范圍，保證每日至少進行一次溫度鑒測并

22、記錄水浴箱 至少每月清潔一次內(nèi)室壁、更換一次水 至少6個月一次 如為連續(xù)工作狀態(tài)，則每日至少檢查一次水位 在使用前應(yīng)先檢查水位

23、 在使用前及使用過程中，應(yīng)對溫度進行連續(xù)監(jiān)測,,除上表所列舉的儀器外，二氧化碳培養(yǎng)箱:除觀察溫度外，還應(yīng)該觀察CO2濃度，每天做好記錄。厭氧設(shè)備：厭氧箱、厭氧盒、厭氧袋 使用時要用指示劑（美蘭）來監(jiān)測環(huán)境厭氧狀態(tài)，也可以用專性需氧菌作指示劑來監(jiān)測環(huán)境。細(xì)菌鑒定系統(tǒng)、血液培養(yǎng)分析系統(tǒng)的質(zhì)量維護對細(xì)菌學(xué)檢查的質(zhì)量保證也非常重要的。但由于各種品牌的儀器的檢測原理、工作模式等不盡相同，所以不可一概而論。制造商們在出售儀器時會同時提供使用手冊，

24、其中對儀器的質(zhì)量維護有詳細(xì)的說明，使用者嚴(yán)格執(zhí)行即可。 20,（六）細(xì)菌染色液的質(zhì)量控制,染色是臨床細(xì)菌學(xué)檢查最常使用的方法，根據(jù)染色部位及染色目的不同可分為革蘭染色、抗酸染色、鞭毛染色、異染顆粒染色和莢膜染色等。其中革蘭染色和抗酸染色使用頻率最高。現(xiàn)對這兩種染色方法的室內(nèi)質(zhì)控加以說明。

25、 21,,革蘭染色 1) 嚴(yán)格按照標(biāo)本收集程序取樣并涂片 2) 對涂片進行嚴(yán)格編號或標(biāo)識 3) 在固定涂片時，避免玻片加熱過度 4) 染液放置處避免高溫、干燥及灰塵 5) 利用過濾的方法去除結(jié)晶紫的固體結(jié)晶 6) 如果盧戈氏碘染液退色，應(yīng)立即更新 7）利用標(biāo)準(zhǔn)菌株（金黃色葡萄球菌 ATCC25923及大腸埃希菌ATCC2592

26、2） 或其他已知的革蘭陽性菌及革蘭陰性菌 至少每周進行一次質(zhì)控驗證 22,,妻-尼染色 1) 嚴(yán)格按照標(biāo)本收集程序取樣并涂片 2) 對涂片進行嚴(yán)格編號或標(biāo)識 3) 每次使用新玻片，不可重復(fù)使用 4) 在固定涂片時，避免玻片加熱過度 5) 利用過濾的方法去除石炭酸復(fù)紅

27、染 液中的沉淀 6) 利用已知的抗酸桿菌（AFB）陽性涂 片每周或在更新石炭酸復(fù)紅染液時至少 進行一次質(zhì)量驗證 7) 陽性涂片應(yīng)置于專門器具專門地點保存 以備復(fù)驗 8) 陰性涂片至少保存兩周以備復(fù)驗 染色液配置后應(yīng)標(biāo)明名稱、日期、配制者 23,七 細(xì)菌鑒定或鑒別常用試驗的質(zhì)量控制,細(xì)菌鑒定或鑒別主要依據(jù)細(xì)

28、菌的形態(tài)特點、染色特點、培養(yǎng)特征、生化反應(yīng)及血清學(xué)特征等。細(xì)菌這些生物表型特征或按固定組合的方式被用于細(xì)菌鑒定，或以靈活組合的方式用于細(xì)菌鑒定、鑒別及補充試驗。無論怎樣，這些生物表型檢測的準(zhǔn)確與否直接影響到細(xì)菌鑒定的準(zhǔn)確性。下面列舉一些常用且較為關(guān)鍵的試驗. 24,表２常用細(xì)菌鑒定或鑒別試驗的質(zhì)量控制,試驗名稱 質(zhì)控

29、周期 陽性質(zhì)控 陰性質(zhì)控 質(zhì)控菌 結(jié)果 質(zhì)控菌 結(jié)果 觸酶試驗

30、 每次使用時 金葡菌 有氣泡產(chǎn)生 化膿性鏈球菌 無變化 凝固酶試驗 每次使用時 金葡菌 與人、兔或豬血 表皮葡萄球菌 無凝固現(xiàn)象

31、 漿產(chǎn)生凝固現(xiàn)象 氧化酶試驗 每次使用時 銅綠 產(chǎn)生蘭紫色 大腸埃希菌 無顏色改變 桿菌肽敏感性試驗 每周 化膿鏈

32、紙片周圍出現(xiàn)抑 無乳鏈球菌 紙片周圍細(xì) 菌圈 菌均一生長 CAMP試驗 與被測試菌同步進行

33、 無乳鏈球菌 質(zhì)控菌生長條 化膿性鏈球菌 無溶血程度 帶在靠近金葡菌 加重區(qū)出現(xiàn)

34、 菌區(qū)內(nèi)出現(xiàn)溶血 加強 膽汁溶菌試驗 每批號（有效期內(nèi)） 肺炎鏈球菌 菌落溶解

35、 緩癥鏈球菌 無菌落溶解現(xiàn)象 膽汁七葉苷試驗 每批號（有效期內(nèi)） 糞腸球菌 使瓊脂斜面變黑 牛鏈球菌 瓊脂斜面無黑色

36、 出現(xiàn) 馬尿酸鹽試驗 每批號（有效期內(nèi)） 無乳鏈球菌 出現(xiàn)深紫色 糞腸球菌 無顏色改變 吲哚試驗 每批號（有效期內(nèi)） 大腸埃希菌 產(chǎn)生紅色 陰溝腸桿菌 無顏色改變

37、 25,抗血清的質(zhì)量控：,用于診斷的各種抗血清進入實驗室應(yīng)記錄收到日期，外觀檢查。注意觀察血清的透明度、色澤等是否合乎標(biāo)準(zhǔn)，如有混濁和絮狀物沉淀表明已被污染為不合格，同時要注意效價、有效期、使前用已知標(biāo)準(zhǔn)菌株做陽性和陰性試驗，過期不能使用。4-8℃冰箱中保存。

38、 26,質(zhì)量控制方法：紙片擴散法藥物敏感試驗的質(zhì)量控制方法：,目的： 質(zhì)控工作的目的是： 監(jiān)測藥敏試驗步驟的精密度和準(zhǔn)確度監(jiān)測試驗所用試劑的質(zhì)量監(jiān)測進行試驗和判讀結(jié)果的工作人員的操作 為達到這些目的，最好選用遺傳性能穩(wěn)定和 在被控的特定方法中有用的參考菌株，但也 可以加用其他菌株. 2

39、7,質(zhì)控菌株：,為控制紙片試驗的精密度和準(zhǔn)確度， 應(yīng)從可靠來源獲取一些質(zhì)控菌株（質(zhì)控菌株一般在國家衛(wèi)生部臨檢 中心或省臨檢中心都可購買到） 28,表3 紙片擴散法藥敏試驗的質(zhì)量控制條件及質(zhì)控菌株,質(zhì)控菌株

40、 試驗條件大腸埃希菌ATCC25922 培養(yǎng)基：Mueller-Hinton瓊脂大腸埃希菌ATCC35218 接種液：生長法或直接菌落懸液(用于β-內(nèi)酰胺類藥/β-內(nèi)酰胺酶抑制劑) 孵育： 35℃：空氣16—18h銅綠假單胞菌ATCC27853

41、 同上 金黃色葡萄球菌25923 培養(yǎng)基：Mueller-Hinton瓊脂 接種液：生長法或直接菌落懸液 

42、 孵育： 35℃：空氣16—18h 如測試苯唑西林、甲氧西林和奈 夫西林時，孵育時間需24 h 糞腸球菌ATCC29212

43、 培養(yǎng)基：Mueller-Hinton瓊脂 接種液：生長法或直接菌落懸液

44、 孵育： 35℃：空氣16—18h 如測試萬古霉素、需要24 h 流感嗜血桿菌ATCC49247 培養(yǎng)基：嗜血桿菌試驗用培養(yǎng)基（HTM） 接種液：直接菌落懸液法

45、 孵育： 35℃：5%CO2：16-18 h 淋病奈瑟菌ATCC49226 培養(yǎng)基：GC瓊脂+1%特定的生長補充品。紙片擴散法不需要使

46、 用無半胱氨酸的生長補充品 接種液：直接菌落懸液法

47、 孵育： 35℃：5%CO2：20-24 h 肺炎鏈球菌ATCC49619 培養(yǎng)基：Mueller-Hinton瓊脂+5%羊血

48、 接種液：直接菌落懸液法 孵育： 35℃：5%CO2：20-24 h

49、 29,,監(jiān)控M-H瓊脂中藥物抑制劑的水平是 否低的可以接受（含量是否符合要求） 用糞腸球菌ATCC29212或糞腸球菌 ATCC33186（抑菌圈≥20mmM-H瓊脂為 合格）糞腸球菌ATCC29212也可用于高 含量氨基糖苷類紙片的質(zhì)控。 一般的實驗室，最少應(yīng)保存三種質(zhì)控 菌 ATCC225922

50、 ATCC225923 ATCC27853 30,質(zhì)控菌株的測試與保存：,質(zhì)控菌株的測試：質(zhì)控菌株的測試應(yīng)按照標(biāo)準(zhǔn)紙片擴散試驗步驟進行，并且使用與臨床分離株相同的抗微生物藥。 質(zhì)控菌株保存：日常所用的質(zhì)控菌應(yīng)貯存在胰大豆瓊脂（非苛養(yǎng)菌） 或營養(yǎng)豐富的巧克力瓊脂斜面（苛養(yǎng)菌），4-8℃ 冰箱保存。

51、長期貯存，可用5%小牛血清肉湯，10%胰大豆肉湯，10%-15%甘油，脫纖維羊血或脫脂牛奶，于-20℃甚至更低溫度保存。 31,,日常所用的質(zhì)控培養(yǎng)物應(yīng)于4-8℃貯存。每周 進行移種。 日常所用的質(zhì)控培養(yǎng)物每月都要用冷凍的或 凍干來更換。 在測試前應(yīng)將菌株在瓊脂平板上進行移種以 獲得單

52、個菌落 按推薦的接種物制備方法，將菌株進行培養(yǎng) 或制成懸液以進行試驗。 只要平均抑菌圈直徑?jīng)]有發(fā)生由于方法錯誤， 造成的有意義的改變，質(zhì)控培養(yǎng)物就可以一 直用于監(jiān)測試驗的精密度和準(zhǔn)確度 32,,如果某意外結(jié)果提示該菌株的內(nèi)在敏感性發(fā)生改變，就應(yīng)換用此質(zhì)控株的新培養(yǎng)物。（如果平均抑菌圈直徑有明顯改

53、變，表示質(zhì)控菌株被污染或敏感性發(fā)生改變，此時，就應(yīng)換用此質(zhì)控株的新培養(yǎng)物） 33,藥敏試驗質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)（瓊脂擴散法）,藥敏紙片： 藥敏紙片的直徑為6.00-6.25mm，吸水性能要很好（每片的吸水量約20µɡ）。邊緣光滑，無毛刺。 藥名代號和藥量標(biāo)記要清楚。紙片的含藥量必須與NCCLs規(guī)定的含藥量

54、一致， 藥物紙片用前必須作質(zhì)量評定。用以下兩個指標(biāo)判定紙片的質(zhì)量 34,,含藥紙片的均勻度： 含藥紙片的均勻度（片間差）測定方法：用質(zhì)控菌株按常規(guī)方法接種菌株后，同一平板貼6張相同的紙片，35OC培養(yǎng)一定時間后，測量抑菌圈直徑，6個抑菌圈直徑相差一般不超過3mm為合格，如果相差太大，說明紙片含量不均。 35,,含

55、藥準(zhǔn)確性： 含藥準(zhǔn)確性：判定紙片的實際含藥量與標(biāo)量是否一致，計算上述六個抑菌圈直徑的平均值與質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)比較，判斷紙片含藥量的準(zhǔn)確性，平均值高或低于質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)表明準(zhǔn)確性差。 36,藥敏紙片的保存：,一般長期保存在-20℃以下的低溫冰箱中。日常工作用，臨時保存在2-8 ℃的冰箱中，但其存放時間不能超過一周。使用前要室溫平衡，用完立即放回冰

56、箱中，不能放實驗室過夜。實驗室過夜的紙片，若想再次使用必須做質(zhì)控，合格才可繼續(xù)使用。某些不穩(wěn)定的藥物，（如亞胺培南、頭孢克洛、克拉維酸復(fù)合藥物）應(yīng)冷凍保存直至用的當(dāng)天取出，以盡量保持其穩(wěn)定性。β-內(nèi)酰胺類藥物紙片應(yīng)密封包裝并冷凍，少量正用的紙片可冷藏至一周。 37,,用紙片分配器時，應(yīng)上緊蓋子并配備足量干燥劑。分配器在打開前應(yīng)預(yù)先平衡至室溫。當(dāng)指示

57、劑變色時，應(yīng)更換干燥劑以防止過于潮濕。裝有紙片的分配器在不用時應(yīng)冷藏。只能使用尚未過期的紙片，過期紙片均應(yīng)棄去，決不能使用。 38,制備接種物時的濁度標(biāo)準(zhǔn)：,1.為使藥敏試驗的接種濁度標(biāo)準(zhǔn)化，應(yīng)使用 一個等同于0.5號麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)管的BaSO4濁度 標(biāo)準(zhǔn)管（此管可以買，也可以自制但一定 要準(zhǔn)確）.2. 在使用前，應(yīng)將濁度標(biāo)準(zhǔn)管置于旋

58、轉(zhuǎn)混勻器 上劇烈振動，目測其外觀濁度應(yīng)均勻一致。 若有大顆粒出現(xiàn)，此標(biāo)準(zhǔn)管應(yīng)更換。3.每個月都應(yīng)更換BaSO4濁度標(biāo)準(zhǔn)管，或者對其 濃度進行核實（BaSO4濁度標(biāo)準(zhǔn)管穩(wěn)定性差）。 39,接種物的制備:,有兩方法：

59、1.生長法 2.直接菌落懸液法 接種物的要求：接種菌液要求純培養(yǎng)物，使用的單個菌落都應(yīng)選自原始的瓊脂平板。 接種菌液濃度要求與0.5號BaSO4麥?zhǔn)蠞?度標(biāo)準(zhǔn)管相同（接種菌液濃度對藥敏試 驗至關(guān)重要，在配置時濃度一定要準(zhǔn)確， 避免過濃或?。?40,試驗平板的接種：,1.接種物懸液的濁度調(diào)整后，最好在15分鐘內(nèi)接種，用無菌棉拭子蘸取調(diào)好的菌液，在液面上方管壁處旋轉(zhuǎn)并用力擠壓幾

60、次，以從中擠出過多的菌液。 2.用棉拭子在無菌的稍干燥的M-H瓊脂表面劃線接種，重復(fù)操作兩次，每次將平板轉(zhuǎn)動約60度。最后沿平板周邊繞兩圈，保證涂布均勻。 3.在貼紙片之前，可以將培養(yǎng)皿蓋半開3-5分鐘， 但不超過15分鐘以使表面過多的水分被吸收。 41,,注意：不同菌種不可在同一平板上做混

61、合細(xì)菌藥敏試驗。避免用臨床標(biāo)本直接作藥敏試驗，除非臨床上急需且革蘭氏染色見到單一菌種，但隨后必須按標(biāo)準(zhǔn)方法重作第二次。禁止用未稀釋的過夜肉湯培養(yǎng)或其他非標(biāo)準(zhǔn)接種物進行平扳劃線。 42,貼紙片要求：,1.將紙片貼到接種好菌的瓊脂平板表面。每個紙片都應(yīng)下壓一下，以保證與瓊脂表面完全接觸。不管紙片是單個

62、貼還是用分配器加，都應(yīng)均勻分布，每張紙片中心間距不少24mm。紙片中心點離平皿內(nèi)壁不少于15mm。青霉素和頭孢菌素紙片離平皿內(nèi)壁10mm以上，兩紙片中心相距至少30mm。一般情況下，150mm平板所貼紙片不應(yīng)超過12個，100mm的不應(yīng)超過5個。一旦紙片接觸了瓊脂表面，就不應(yīng)再挪動位置，因為有些藥物幾乎立即擴散，而應(yīng)該在需要的地方貼新的紙片。 43,,2.貼

63、完紙片后，應(yīng)在15分鐘內(nèi)，將平板反轉(zhuǎn)過來，置于35℃溫箱中孵育。除嗜血桿菌、淋病奈瑟菌和鏈球菌以外，平板不應(yīng)放在CO2含量高的空氣中孵育，因為其抑菌圈解釋標(biāo)準(zhǔn)是根據(jù)普通空氣中的孵育結(jié)果研究出的，CO2可使培養(yǎng)基PH變酸，還會顯著改變某些藥物的抑菌圈大小。

64、 44,判讀平板和解釋結(jié)果：,1.孵育16-18小時后，檢查每一塊平板，如果平板劃線滿意，接種物準(zhǔn)確無誤，菌落應(yīng)相互融合生長。如果出現(xiàn)明顯的單個菌落，是因為接種量太少(或菌液太淡) ，必須重復(fù)試驗，測量的應(yīng)

65、該是完全抑制區(qū)域的直徑（肉眼判讀），包括紙片直徑。 45,,2.抑菌圈的測量可以用游標(biāo)卡尺，尺子或特制的模板，測量到最接近的整數(shù)毫米數(shù)。如果是加血的瓊脂培養(yǎng)基（如對鏈球菌），則應(yīng)在透射光照射下，打開培養(yǎng)皿蓋，從上表面測量抑菌圈。如果被測菌是葡萄菌或腸球菌，則應(yīng)孵育2

66、4小時，再在透射光下分別觀察笨唑西林或萬古霉素的透明抑菌圈內(nèi)有無耐苯唑西林或耐萬古霉素菌落的微弱生長。抑菌圈內(nèi)的任何可見的生長，都表示苯唑西林或萬古霉素耐藥。 46,,3.抑菌圈邊緣應(yīng)是肉眼觀察無明顯生長區(qū)域。如果在抑菌圈的邊緣有微弱的小菌落生長，而且只有用放大鏡才能看到，這些菌落就應(yīng)該忽略。如

67、果在透明的抑菌圈內(nèi)有任何的單個菌落，都應(yīng)該進行二次培養(yǎng)，重新鑒定重新試驗，變形桿菌屬的菌株可能會在某些抗微生物藥的抑菌圈內(nèi)蔓延生長。對于變形桿菌屬，在本該十分明顯的抑菌圈內(nèi)薄紗樣蔓延生長，也應(yīng)該忽略。對于甲氧芐啶和磺胺，培養(yǎng)基內(nèi)的藥物拮抗劑可能使細(xì)菌能微弱的生長，因此應(yīng)忽略微弱的生長（生長的菌膜20%或更少），并且應(yīng)測量更為明顯的邊緣來決定抑菌圈的直徑。用加血培養(yǎng)基測試鏈球菌時應(yīng)該測量生長受抑制的區(qū)域，而不是溶血受抑制的區(qū)域。

68、 47,M-H瓊脂培養(yǎng)基質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)：,在眾多現(xiàn)用的培養(yǎng)基中，M—H瓊脂最適于常規(guī)藥敏試驗，對于非苛養(yǎng)菌的常規(guī)藥敏試驗是最好的。原因如下：它的藥敏試驗的批間重復(fù)性好。它含有的磺胺、甲氧芐啶和四環(huán)素的抑制物很少它可使絕大多數(shù)非苛養(yǎng)病原菌獲得滿意生長.用它進行的藥敏試驗已積累了大量的數(shù)據(jù)和經(jīng)驗（盡管M—H瓊脂培養(yǎng)基用于藥敏試驗通常是可靠的，但偶然也有產(chǎn)