大豆鋁毒脅迫響應(yīng)的一氧化氮信號(hào)調(diào)控機(jī)理.pdf

1、一氧化氮(nitric oxide，NO)是一種普遍存在于植物體內(nèi)的氣體信號(hào)分子，參與了植物的生長(zhǎng)和發(fā)育，以及對(duì)多種逆境脅迫（病蟲害、高溫、干旱、水分脅迫、鹽脅迫和金屬脅迫等）的防御過程。并且，NO也參與了植物耐鋁毒的調(diào)控過程，然而NO介導(dǎo)的植物耐鋁的作用機(jī)制并不清楚。本論文首先以兩個(gè)耐鋁性有顯著差異的大豆品種為材料，比較鋁脅迫下兩種大豆的內(nèi)源NO代謝，確定NO是否在大豆耐鋁中起作用及其來源。接著通過外源NO供體硝普鈉(sodiumni

2、troprusside，SNP)和NO清除劑2-(4-羧基苯)-4，4，5，5-四甲基咪唑-1-氧-3-氧化物，鉀鹽（carboxy-PTIO，cPTIO）預(yù)處理，以確定NO在鋁誘導(dǎo)的氧化脅迫和細(xì)胞壁硬化方面的作用。具體研究結(jié)果如下:
　　 (1)以耐鋁能力有顯著差異的大豆浙秋2號(hào)（鋁耐性品種）和浙春3號(hào)（鋁敏感品種）為材料，研究鋁脅迫下兩種大豆的內(nèi)源NO代謝規(guī)律和活性氧(reactive oxygen species，ROS)

3、的變化。結(jié)果表明，50μmol·L-1 Al處理引起兩品種大豆根尖NO、O2和H2O2的含量顯著上升。其中，浙秋2號(hào)的NO增幅高于浙春3號(hào)，而根尖O2-含量和H2O2含量則是前者比后者分別降低了15.54％和9.04％。鋁處理48h后，浙秋2號(hào)的超氧化物岐化酶(superoxid dismutase，SOD)、過氧化物酶(peroxidase，POD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GPX)和過氧化氫

4、酶(catalase，CAT)活性分別比浙春3號(hào)提高了95.31％、122.98％、11.19％和191.56％，同時(shí)根伸長(zhǎng)抑制率和根尖Al積累量也顯著低于浙春3號(hào)。結(jié)果表明鋁毒誘導(dǎo)大豆內(nèi)源NO和ROS積累，其中耐性大豆的NO產(chǎn)生量和ROS的清除能力高于敏感大豆。可見，與敏感品種相比，耐性品種浙秋2號(hào)根尖積累的NO更明顯，ROS積累較少，即受到的氧化脅迫較弱。以上結(jié)果表明，NO在大豆耐鋁過程中起作用;鋁脅迫下，積累的NO可能通過提高抗氧

5、化酶活性的方式來清除ROS積累以緩解鋁誘導(dǎo)的氧化脅迫，最終提高大豆的耐鋁能力。
　　 (2)以浙春3號(hào)為材料，采用一氧化氮合酶(NO synthase，NOS)抑制劑N-硝基左旋精氨酸(Nù-nitro-L-arginine，L-NNA)和硝酸還原酶(nitrate reductase，NR)抑制劑鎢酸鈉(tungstate，Na2WO4)預(yù)處理抑制內(nèi)源NO產(chǎn)生，探究鋁毒下大豆根尖NO合成途徑。結(jié)果表明，L-NNA預(yù)處理的根相對(duì)

6、伸長(zhǎng)率和根尖Al積累與單鋁處理無顯著差異，且其NO含量也沒顯著變化;而Na2WO4預(yù)處理的根相對(duì)伸長(zhǎng)率、根尖NO含量要顯著低于單鋁處理，根尖鋁積累顯著增加。并且鋁脅迫下Na2WO4預(yù)處理使NR活性顯著降低了64.79％，L-NNA預(yù)處理對(duì)NR活性的作用不顯著，降低了11.68％。而鋁脅迫下的NOS活性未檢測(cè)出來。以上結(jié)果表明鋁脅迫下根尖內(nèi)源NO的合成主要來源于NR途徑。
　　 (3)以浙春3號(hào)大豆為實(shí)驗(yàn)材料，采用NO供體(SNP

7、)和NO清除劑(cPTIO)調(diào)節(jié)NO的產(chǎn)生，研究NO在鋁誘導(dǎo)氧化脅迫中的作用和調(diào)控機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，外源NO供體(SNP)降低鋁誘導(dǎo)的根伸長(zhǎng)抑制和細(xì)胞膜損傷程度，減少Al在根尖積累，即NO有助于提高大豆的耐鋁能力。同時(shí)NO供體預(yù)處理提高了根尖抗氧化酶（SOD、POD、CAT和GPX）活性，降低了根尖O2-的積累，促使根尖H2O2積累。然而，SNP的這些作用可以被NO清除劑cPTIO逆轉(zhuǎn)。以上結(jié)果表明，NO通過提高根尖抗氧化酶活性來緩解鋁誘

8、導(dǎo)的氧化脅迫，從而提高了大豆的耐鋁能力，而其中H2O2可能起到了一種信號(hào)分子作用。
　　 (4)為了確定NO和H2O2在大豆根尖和邊緣細(xì)胞(root border cells，RBCs)耐鋁反應(yīng)中是否起作用及其相互關(guān)系，以浙春3號(hào)大豆(Glycine max L.)為材料，施加外源NO和H2O2供體和清除劑以研究鋁毒脅迫下大豆根尖內(nèi)源NO和H2O2的變化，以及外源NO和H2O2誘導(dǎo)大豆根尖和RBCs的耐鋁反應(yīng)。結(jié)果表明:50μm

9、ol·L-1 Al處理顯著提高根尖內(nèi)源NO和H2O2的含量。并且，施加外源NO供體和H2O2可以有效地緩解Al對(duì)大豆根伸長(zhǎng)的抑制、減少Al在根尖的積累及Al誘導(dǎo)的RBCs死亡。而NO吞噬劑(cPTIO)和H2O2清除酶CAT則清除甚至逆轉(zhuǎn)了NO和H2O2的緩解作用。這些結(jié)果均表明NO和H2O2在誘導(dǎo)大豆根尖及RBCs的耐鋁反應(yīng)中有一定的積極作用。進(jìn)一步試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NO誘導(dǎo)大豆根尖H2O2的積累，而H2O2對(duì)大豆根尖NO的積累無顯著影響

10、。以上結(jié)果表明在Al毒害下NO通過調(diào)控H2O2的形成，進(jìn)而誘導(dǎo)大豆根尖及RBCs的耐鋁反應(yīng)。其中，H2O2可能位于NO調(diào)控的這條信號(hào)途徑的下游，其通過激活抗氧化防衛(wèi)反應(yīng)或細(xì)胞程序性死亡等信號(hào)途徑來抵御鋁毒傷害。
　　 (5)以浙春3號(hào)大豆為材料，通過外源NO供體(SNP)和NO清除劑(cPTIO)預(yù)處理，探究NO介導(dǎo)的細(xì)胞壁松弛在大豆耐鋁中的作用機(jī)理。結(jié)果表明，0.25mmol·L-1的NO供體硝普鈉(SNP)預(yù)處理降低了鋁脅迫

11、下大豆細(xì)胞壁過氧化物酶(cPOD)、漆酶及草酸氧化酶(oxalate oxidase，OXOs)活性，減少根尖H2O2含量及木質(zhì)素的積累，該作用可以被NO清除劑cPTIO逆轉(zhuǎn)。另外，0.25mmol·L-1的SNP預(yù)處理顯著減少了Al在根尖及根尖細(xì)胞壁的積累和提高根尖多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase，PG)活性，同時(shí)降低了細(xì)胞壁組分果膠和半纖維素2的含量和果膠甲基酯化酶（pectin methyl esterifyi