構(gòu)建轉(zhuǎn)基因魚類細(xì)胞以快速檢測(cè)環(huán)境污染物的遺傳毒性.pdf

1、細(xì)胞內(nèi)的p53信號(hào)通路可以感受DNA損傷信號(hào)，激活并上調(diào)胞內(nèi)p53蛋白的活性和水平，而p53蛋白則誘導(dǎo)一系列與細(xì)胞周期停滯、DNA修復(fù)和凋亡相關(guān)的下游靶基因的表達(dá)，從而使細(xì)胞周期停滯，給細(xì)胞足夠的時(shí)間修復(fù)DNA損傷；如果DNA損傷太嚴(yán)重而無法修復(fù)，則誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而保證了基因組DNA的完整性。周期蛋白依賴性激酶(Cdks)的抑制因子p21(WAF1/Cip1)是p53蛋白的下游靶基因，參與細(xì)胞周期停滯的誘導(dǎo)。在本研究中，我們將表達(dá)質(zhì)粒

2、pGL3-p21-luc(人p21基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因)和pRL-CMV-luc(CMV強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的海腎熒光素酶報(bào)告基因)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到海水魚牙鲆鰓細(xì)胞系FG中，從而成功構(gòu)建了一種用來檢測(cè)環(huán)境污染物或化學(xué)藥品的遺傳毒性的轉(zhuǎn)基因魚類細(xì)胞遺傳毒性檢測(cè)系統(tǒng)，這種細(xì)胞命名為p21FGLuc。當(dāng)遺傳毒性物質(zhì)引起p21FGLuc細(xì)胞發(fā)生DNA損傷時(shí)，螢火蟲熒光素酶的報(bào)告基因就會(huì)被轉(zhuǎn)錄激活并表達(dá)，而海腎熒光素酶報(bào)告基因是組成型表達(dá)，起

3、到內(nèi)對(duì)照的作用，降低實(shí)驗(yàn)誤差。因此，該轉(zhuǎn)基因魚類細(xì)胞遺傳毒性檢測(cè)系統(tǒng)是利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)技術(shù)，通過檢測(cè)環(huán)境污染物或化學(xué)藥品處理后，是否能誘導(dǎo)p21FGLuc細(xì)胞的相對(duì)熒光信號(hào)(螢火蟲熒光信號(hào)/海腎熒光信號(hào))提高，來達(dá)到檢測(cè)遺傳毒性的目的。
　　 本文首先對(duì)FG細(xì)胞的轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，F(xiàn)G細(xì)胞的最佳轉(zhuǎn)染條件為：轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine LTX&PLUS最好，對(duì)FG細(xì)胞的毒性最小，轉(zhuǎn)染效果最好；24孔板

4、轉(zhuǎn)染時(shí)，DNA總量為500 ng時(shí)可以得到最好的轉(zhuǎn)染效果；在共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，表達(dá)質(zhì)粒與內(nèi)參質(zhì)粒在5:1時(shí)，熒光蛋白的表達(dá)信號(hào)最強(qiáng)。
　　 其次，本文將攜帶有人p53基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因的質(zhì)粒和人p21基因的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因的質(zhì)粒，分別共轉(zhuǎn)染到FG細(xì)胞中，然后通過DNA損傷試劑博萊霉素(bleomycin)處理共轉(zhuǎn)染后的FG細(xì)胞，并檢測(cè)熒光蛋白的表達(dá)情況，來確定FG細(xì)胞內(nèi)的p53信號(hào)通路的完整性。

5、結(jié)果表明，F(xiàn)G細(xì)胞具有完整的p53信號(hào)通路，表達(dá)野生型p53蛋白，而且牙鲆p53的蛋白可以識(shí)別人啟動(dòng)子p21，并激活與這個(gè)啟動(dòng)子相連的螢火蟲熒光素酶基因的表達(dá)，這是本文利用該細(xì)胞系建立遺傳毒性檢測(cè)系統(tǒng)的先決條件。
　　 再次，本文檢測(cè)了FG細(xì)胞對(duì)G418的抗性，確定了G418對(duì)轉(zhuǎn)染后FG細(xì)胞進(jìn)行篩選的最佳濃度是600μg/ml，維持篩選濃度為300μg/ml。并通過G418篩選，將pGL-3-p21-luc質(zhì)粒、pRL-CMV質(zhì)

6、粒和pcDNA3.1這三種質(zhì)粒按照5:1:1的比例共轉(zhuǎn)染到FG細(xì)胞后，得到了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞：p21FGLuc。
　　 最后，本文通過具有不同毒性作用機(jī)制的遺傳毒物和非遺傳毒物處理該細(xì)胞p21 FGLuc，以驗(yàn)證該遺傳毒性檢測(cè)系統(tǒng)在檢測(cè)環(huán)境污染物或化學(xué)藥品的遺傳毒性上的特異性、靈敏度和可靠性。結(jié)果表明，該遺傳毒性檢測(cè)系統(tǒng)，能高效應(yīng)答遺傳毒物博來霉素(bleomycin)和絲裂霉素C(mitomycin C)對(duì)細(xì)胞DNA的損傷，并且表

7、現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)關(guān)系，但是對(duì)非遺傳毒性物質(zhì)酒精(ethanol)卻沒有應(yīng)答反應(yīng)；對(duì)遺傳毒性物質(zhì)的應(yīng)答，該系統(tǒng)的反應(yīng)很迅速，而且在不同的處理時(shí)間段內(nèi)，所誘導(dǎo)的報(bào)告基因的表達(dá)很穩(wěn)定；在相似的細(xì)胞毒性下，博來霉素(bleomycin)處理組的遺傳毒性要高于絲裂霉素C(mitomycin C)處理組。這表明，該轉(zhuǎn)基因魚類細(xì)胞遺傳毒性檢測(cè)系統(tǒng)具有很好的特異性。鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)是一種增塑劑，是目前世界上最廣泛存

8、在的環(huán)境污染物之一。DEHP在細(xì)菌、酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞遺傳毒性檢測(cè)系統(tǒng)中以及微核和染色體畸變實(shí)驗(yàn)中，均顯示陰性結(jié)果，但是DEHP可引起嚙齒類動(dòng)物肝臟致癌。本文的p21FGLuc細(xì)胞對(duì)DEHP的遺傳毒性檢測(cè)結(jié)果為陽性，首次提供了DEHP具有遺傳毒性的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，但是具體作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。在環(huán)境濃度條件下(0.005μg/ml)，DEHP就可以明顯誘導(dǎo)p21FGLuc細(xì)胞的DNA損傷反應(yīng)，在50μg/ml時(shí)，DNA損傷反應(yīng)達(dá)到峰值?？梢?/p>

9、，p21FGLuc系統(tǒng)在檢測(cè)DEHP的遺傳毒性上比其它系統(tǒng)要靈敏得多。環(huán)磷酰胺本身沒有致突變作用但是在體內(nèi)經(jīng)肝臟代謝后就會(huì)產(chǎn)生具有烷化作用的代謝產(chǎn)物，可引起DNA損傷。由于大多數(shù)的細(xì)胞不具有代謝活化的能力，因此在體外實(shí)驗(yàn)中，這類間接致突變物需要用S9復(fù)合物激活系統(tǒng)對(duì)藥物進(jìn)行處理。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，環(huán)磷酰胺只有在S9復(fù)合物存在的情況下才表現(xiàn)出遺傳毒性。D-甘露醇是一種無遺傳毒性的化學(xué)物質(zhì)，在熒光檢測(cè)中沒有引起熒光信號(hào)的改變。以上結(jié)果表明，該

10、轉(zhuǎn)基因魚類細(xì)胞遺傳毒性檢測(cè)系統(tǒng)具有很好的靈敏度。
　　 但是該系統(tǒng)也有個(gè)不足之處，丁酸鈉處理該細(xì)胞后，可以以不依賴p53信號(hào)通路的方式激活p21基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光蛋白酶的表達(dá)，提高了該檢測(cè)系統(tǒng)在檢測(cè)遺傳毒性時(shí)的假陽性率。但是，這一缺陷可通過在p53-/-的細(xì)胞中，建立以上調(diào)表達(dá)p53蛋白為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞遺傳毒性檢測(cè)系統(tǒng)來解決。
　　 總之，本研究所構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因魚類細(xì)胞遺傳毒性檢測(cè)系統(tǒng)在檢測(cè)環(huán)境污染物和藥物的遺傳毒性上