貼壁細(xì)胞的免疫熒光染色方法-生物探索-探索生物科技價值的

1、<p>　　貼壁細(xì)胞的免疫熒光染色方法</p><p>　　Materials:</p><p>　　1. PBS solution</p><p>　　2. 4% Paraformaldehyde (PFA fixative):</p><p>　　Dissolve 4g paraformaldehyde in 100ml PBS

2、 solution, stir at 70℃ to dissolve;</p><p>　　3. PBS-T solution: (0.1% Triton X-100 in PBS solution)</p><p>　　4. PBS-B blocking solution: (4% BSA in PBS solution)</p><p>　　5. Primary

3、 antibody: Dilute with PBS-B solution, dilution factors should refer to manual, or, test from 1:50~200, should be more concentrate than application in Western blot;</p><p>　　6. Secondary antibody: Dilute wit

4、h PBS-B solution, dilution factors should refer to manual</p><p>　　Procedure:</p><p>　　1. Cultured cells, let it attach to the coverslips in 6-well plate;</p><p>　　2. Remove medium,

5、 rinse with PBS twice;</p><p>　　3. Add 2ml 4% paraformaldehyde, incubate at room temperature for 20 minutes;</p><p>　　4. Rinse with 2ml PBS three times, rinse for 5 minutes every time;</p>

6、<p>　　5. Permeabilize cells with 2ml PBS-T solution at 4?C for 10 minutes;</p><p>　　6. Remove PBS-T solution, rinse cells with PBS for 5 minutes at room temperature;</p><p>　　7. Block non

7、-specific interaction with PBS-B solution at 37?C for 30 minutes;</p><p>　　8. Add primary antibody solution, incubate at 4?C overnight;</p><p>　　9. Remove primary antibody solution, wash with PB

8、S for 5 minutes;</p><p>　　10. Add secondary antibody solution, incubate at room temperature for 1 hour;</p><p>　　11. Wash with PBS three times, 5 minutes each;</p><p>　　12. Add anti

9、-fade DAPI solution if needed;</p><p>　　13. Observation.</p><p><b>　　細(xì)胞免疫熒光步驟</b></p><p><b>　　1.細(xì)胞爬片；</b></p><p>　　2.4%多聚甲醛固定10min(固定細(xì)胞器用預(yù)冷的70%甲

10、醇+30%丙酮)；</p><p>　　3.PBS漂洗5min；</p><p>　　4.0.5% Triton 穿孔15min(丙酮固定法不用透化處理)；</p><p>　　5.PBS漂洗2次，每次5min；</p><p>　　6.1%BSA封閉30min；</p><p>　　7.加入1%BSA稀釋的一抗，于3

11、7℃雜交2h；</p><p>　　8.PBS漂洗2次，每次5min；</p><p>　　9.加入1%BSA稀釋的二抗，于37℃雜交1h；</p><p>　　10.PBS漂洗2次，每次5min；</p><p>　　11.5ug/ml DAPI染色2min；</p><p>　　12.抗淬滅封片劑封片。</p

12、><p><b>　　抗淬滅封片劑:</b></p><p>　　2.5% DABCO (w/v)</p><p>　　50mM Tris(pH8.0)</p><p><b>　　90%甘油</b></p><p>　　作為熒光顯微鏡使用：</p><p&g

13、t;　?。?）先關(guān)閉熒光通道，再打開熒光激發(fā)器電源，等待15分鐘。</p><p>　?。?）等待期間，打開顯微鏡光源，找到需要觀察的樣品，選用合適的物鏡，調(diào)整焦距。</p><p>　?。?）關(guān)閉顯微鏡光源，打開熒光通道。</p><p>　?。?）需要圖片，要把鏡體上的相應(yīng)拉桿拉到綠線位子。按下相應(yīng)附件上的照相按扭。</p><p>　　

14、作為熒光顯微鏡使用：</p><p>　?。?）先關(guān)閉熒光通道，再打開熒光激發(fā)器電源，等待15分鐘。</p><p>　?。?）等待期間，打開顯微鏡光源，找到需要觀察的樣品，選用合適的物鏡，調(diào)整焦距。</p><p>　　（3）關(guān)閉顯微鏡光源，打開熒光通道。</p><p>　?。?）需要圖片，要把鏡體上的相應(yīng)拉桿拉到綠線位子。按下相應(yīng)附件上

15、的照相按扭。</p><p><b>　　細(xì)胞免疫熒光</b></p><p><b>　　細(xì)胞爬片</b></p><p>　　4%多聚甲醛固定10min</p><p>　　(固定細(xì)胞器用預(yù)冷的70%甲醇+30%丙酮)</p><p><b>　　PBS漂洗5m

16、in</b></p><p>　　0.5% Triton 穿孔15min</p><p>　　(丙酮固定法不用透化處理)</p><p>　　PBS漂洗2次，每次5min</p><p>　　1%BSA封閉30min</p><p>　　加入1%BSA稀釋的一抗，于37℃雜交2h</p>&l

17、t;p>　　PBS漂洗2次，每次5min</p><p>　　加入1%BSA稀釋的二抗，于37℃雜交1h</p><p>　　PBS漂洗2次，每次5min</p><p>　　5ug/ml DAPI染色2min</p><p><b>　　抗淬滅封片劑封片</b></p><p>　　2.5

18、% DABCO (w/v)</p><p>　　抗淬滅封片劑 50mM Tris(pH8.0)</p><p><b>　　90%甘油</b></p><p>　　0.25g DABCO</p><p><b>　　9ml甘油</b></p><p>　　0.5ml

19、1M Tris(Ph8.0) 70℃溶解，-20℃保存</p><p>　　0.5ml ddH2O</p><p>　　2005-07-25 20:25 </p><p>　　免疫熒光第一步的步驟幾注意事項1.首先是玻片的處理:泡酸去污, 沖洗, 晾干, 泡純酒精脫脂, 蒸餾水洗(此時要用鑷子夾著洗), 晾干備用.2.不知道你做的細(xì)胞是貼壁比較好的細(xì)胞比如

20、干細(xì)胞,還是貼壁不大好的細(xì)胞比如神經(jīng)元前者的話可以不用多聚賴氨酸包被玻片,后者爬片之前要包被多聚賴氨酸以免洗片時細(xì)胞掉片3. 固定,我用的是預(yù)冷純丙酮固定15分鐘(應(yīng)為丙酮有毒,操作的時候小心些),這步應(yīng)該注意:丙酮很容易揮發(fā),但又要保證固定期間不能干片,所以要多滴加丙酮,其間用蓋子蓋住,這一步不要在6孔板內(nèi)進行,因為丙酮會將其熔化.4. 不知道你的一抗是 在胞漿表達還是在胞核表達如果在胞漿表達,可以不用0.01%的TRITON

21、 X-100滲透(我前幾次用了TRITON,結(jié)果胞核也表現(xiàn)出很強的熒光), 當(dāng)然,如果一抗是在胞核內(nèi)表達要用TRITON 滲透15分鐘5. 5%的正常山羊血清或是5%的BSA封閉,注意這一步不要洗,只是甩掉多余的封閉液.6. 加一抗,根據(jù)你所做抗體的需求稀釋,一般是先將稀釋液加到EP管里,后加一抗.(一抗在吸出來之前要離心10-20秒),一抗的量要多加些,也是為了避免</p><p>　　孵育一抗不能干片,孵

22、育一抗時間要久;其四,多余的封閉液不能洗掉,只能甩干</p><p>　　2005-07-25 20:51 </p><p>　　總之,首先,應(yīng)該注意的是片子有沒進行了脫脂處理;其二,注意洗片用PBS的PH植要在7.4左右;其三,固定,孵育一抗不能干片,孵育一抗時間要久;其四,多余的封閉液不能洗掉,只能甩干;其五,要注意避光說了這么多,嘿嘿,最重要的一點是:你以后闡述問題的時候請具體一

23、點,不要讓回答問題的人遍地撒網(wǎng),好累呀!!!</p><p>　　2009-01-23 10:50 </p><p>　　首先 用16孔板 沒有任何問題分析 沒有熒光的結(jié)果1. 固定最好用4%多聚甲醛 30min2. 一抗 孵育時間太短 我的經(jīng)驗 37度 2小時 或者4度 過夜 效果更好3. 二抗孵育時間是多少？ 建議 37度2--3小時 我也有做過 5個小時的最后 你用的是那

24、種ccd的熒光顯微鏡嗎？ 有的時候染的不好鏡下看不到熒光 但是是可以照出來的！！</p><p>　　Fix cells in 2% formaldehyde in PBS/pH 7.4 for 15 min. at 20oC. 2% formaldehyde is made up fresh prior to use by dissolving the appropriate amount of EM grad

25、e paraformaldehyde (Prill form, from Electron Microscopy Sciences) in PBS and heating on a hot plate in the hood (setting of 5-6) until the aldehyde goes into solution. Keep the bottle cap loosened so that pressure does

26、not build up. Cool down to 20oC and pH to 7.4. Alternatively, cells may be fixed in 100% methanol at -20oC for 3 minutes. I</p><p>　　liguofan wrote:多聚甲醛固定[24孔中加多少?。縘,</p><p>　　0.5-1.0 ml;</p

27、><p>　　liguofan wrote:加1抗，[不用濕盒，如何防干燥？用個大飯盒，加上水，蓋上蓋，過夜？]</p><p>　　parafilm覆蓋，或?qū)overslips倒扣在載玻片上后照你的方法，另外飯盒里可以放上紗布；</p><p>　　liguofan wrote:封片[如何做？]</p><p>　　如果立即觀察、拍照，可

28、以用PBS封片，若放置一定時間則請用水溶性封固劑封片并置4度保存。背景非特異熒光較多, 加一抗或二抗前是否有必要加用動物血清溫育一遍? 我們用1%BSA封閉半個小時。能否直接在6孔板或者12孔內(nèi)操作?可以的，選擇合適的蓋玻片。我們一直這么做。是否需要封片?用什么為好?直接觀察，不用封。如果要封，可用香柏油一滴。若在培養(yǎng)箱內(nèi),是否還有必要用濕盒?不用也可以。玻片用95%浸泡多久,泡后還用二蒸水沖凈再高壓?95

29、%的酒精泡1-2個小時，三蒸水沖凈，用紗布包好裝飯盒高壓。熒光素標(biāo)的二抗及一抗能用PBS配嗎?(0.02M)可以。</p><p>　　每次試驗時，需設(shè)置以下三種對照：</p><p>　?。?） 陽性對照：陽性血清+熒光標(biāo)記物</p><p>　　（2） 陰性對照：陰性血清+熒光標(biāo)記物</p><p>　?。?） 熒光標(biāo)記物對照：PB

30、S+熒光標(biāo)記物 </p><p>　　parafilm或coverslips起的作用：可以減少抗體用量（窮啊，沒辦法），還可以減小撒開來的概率；封片用PBS，還是甘油，即刻觀察、拍照情況下無所謂的，至于量嗎，盡量少就是了，但前提是封好片別出現(xiàn)氣泡哦（要練的）。 </p><p>　　1、將爬有細(xì)胞的蓋玻片，PBS洗3次，每次3分鐘。2、加入4％多聚甲醛，固定10分鐘，PBS洗3次。

31、3、用含0.2％TritonX-100 的PBS溶液透化固定后的細(xì)胞3分鐘，PBS洗滌細(xì)胞3次。4、在Parafilm膜上滴加5％BSA封閉液50μl，將蓋玻片有細(xì)胞的一面向下蓋在封閉液上，室溫封閉20分鐘。甩去多余液體，不洗。5、在Parafilm膜上加一抗，將蓋玻片有細(xì)胞的一面向下蓋在抗體上，置濕盒中于37℃孵箱中孵育2小時。陰性對照用PBS代替一抗。6、PBS洗3次, 每次5分鐘。7、在Parafilm膜上加二抗50，將蓋

32、玻片有細(xì)胞的一面向下蓋在二抗上，37℃孵育30分鐘。8、PBS洗3次, 每次5分鐘。9、在Parafilm膜上加SABC試劑50μl，將蓋玻片有細(xì)胞的一面向下蓋在其上，37℃靜置20分鐘。10、PBS洗4次, 每次5分鐘。11、將新鮮配制的DAB試劑加入樣品。鏡下控制反應(yīng)時間，一般在5～10分鐘之間。蒸餾水漂洗數(shù)次終止反應(yīng)。、呵呵，所謂的Parafilm膜就是咱們常用的封口膠，用來做這個也很好用。把蓋玻片倒扣在封口膠上，再放在

33、濕盒里孵育的話，</p><p>　　Dear Pro. John M. Koomen:I'm a teacher in Nanjing Medical University,china. I'm very intrested  in your the research paper published in JBC 2010 and titled "IKK

34、 epsilon phosphorylation of estrogen receptor alpha Ser-167 and contribution to tamoxifen resistance in breast cancer" .You have done a good job.But I can only get the abstract, would you please send me the ful