丹參素靶向乙肝病毒逆轉錄酶抗乙肝及抗原表達影響機制研究

1、<p>　　丹參素靶向乙肝病毒逆轉錄酶抗乙肝及抗原表達影響機制研究</p><p>　　[摘要]該文采用MTT法測定丹參素對轉染人肝癌細胞株（HepG2）的2215細胞活性的抑制作用，通過間接熒光標記法測定細胞內(nèi)活性氧水平的變化；采用ELISA法測定細胞上清乙肝表面抗原（HBsAg）和E抗原（HBeAg）水平，采用熒光定量PCR法檢測HBV DNA水平；利用酶抑制動力學方法，研究了丹參素對HBV RT的

2、抑制作用；最后利用圓二色譜法監(jiān)測丹參素對HBV逆轉錄酶二級結構的影響。結果顯示丹參素能夠對HepG2215細胞的生長起到良好的抑制作用，半抑制濃度IC50為（1535±243） μmol?L-1；丹參素能顯著抑制HBsAg和HBeAg表達，同時對HBV DNA復制具有抑制作用；此外，丹參素是一種有效的HBV逆轉錄酶抑制劑[半抑制濃度IC50為（2132±243）μmol?L-1]，熒光標記法檢測，細胞內(nèi)活性氧水平隨著

3、丹參素呈濃度依賴性升高；圓二色譜分析表明丹參素誘導HBV逆轉錄酶的構象發(fā)生部分改變，α螺旋含量逐漸增加。結果表明丹參素能夠通過結合HBV逆轉錄酶，誘導酶的結構變得緊密，而不利于活性中心的形成，最終使HBV逆轉錄酶活性降低。而這種誘導酶的活性降低直接影響到乙肝病毒</p><p>　　[關鍵詞]丹參素；HepG2215細胞；乙肝病毒逆轉錄酶；活性氧；二級結構；抑制作用 </p><p>　　

4、[Abstract]MTT assay was used in this study to investigate the inhibitory effect of danshensu on the activity of 2215 cells among human hepatoma cell line （HepG2）； indirect fluorescence labeling method was used to measure

5、 the changes of reactive oxygen levels in the cells； ELISA method was used to determine hepatitis B surface antigen （HBsAg） and hepatitis B e antigen （HBeAg） levels in cellular supernatants； HBV DNA level was measured wi

6、th fluorogenic quantitative PCR method The inhibitory effect</p><p>　　[Key words]danshensu； HepG2215 cells； reverse transcripatase of HBV； reactive oxygen species； secondary structure； inhibitory effect 　　d

7、oi：10.4268/cjcmm20160722 </p><p>　　丹參素（danshensu）屬于酚性芳香酸類化合物，大量存在于丹參類植物中；丹參素有多種藥理活性[12]，對心肌缺血的保護作用，抑制血小板聚集及抗凝作用，對動脈粥樣硬化的拮抗作用及降血脂作用，抗菌消炎及增強機體免疫作用和抗腫瘤作用，而其中其對肝臟的保護作用在近年來受到廣泛關注，蔣莉等[3]研究發(fā)現(xiàn)丹參素能夠對內(nèi)毒素引起的肝損傷起到良好的保護作

8、用；鄭元義等[4]發(fā)現(xiàn)丹參素能夠對免疫性肝纖維化有明顯的抑制效果。大量研究表明慢性乙型肝炎（HBV）所引起的感染，能夠導致肝硬化和肝癌的發(fā)生，因此乙肝病毒的逆轉錄酶在病毒復制中具有十分重要的作用，可作為研究抗病毒藥物丹參素的重要靶點[5]，為丹參素在乙肝病毒治療領域的開發(fā)和應用提供實驗依據(jù)。 </p><p><b>　　1材料與方法 </b></p><p>　　1

9、1細胞株乙型肝炎病毒（HBV）DNA轉染人肝癌細胞株（HepG2）的2215細胞 （中國科學院典型培養(yǎng)物種保藏委員會細胞庫），在本實驗室進行培養(yǎng)。 </p><p>　　12儀器與試劑丹參素（分析對照品，20 mg）購自Sigmaaldrich（上海）貿(mào)易有限公司；拉米夫定（01 g/片）購自CiplaLtd公司，批號G25193；RPMI 1640 培養(yǎng)基購自賽默飛世爾生物化學 （北京）有限公司；優(yōu)級肽牛/小牛

10、血清購自澳大利亞 PAA 公司；CaspaseGlooR3檢測試劑盒購自Sigmaaldrich（上海）貿(mào)易有限公司；胰蛋白酶購自美國 Gibco公司；二甲基亞砜（DMSO）購自阿拉丁試劑（上海）有限公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT，5×103 mg?L-1，PBS配制）購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。酶標儀SpectraMax Plus384購自美谷分子公司；生物安全柜，型號HR40ⅡA2 Haier，購自青島海爾醫(yī)用低溫

11、科技有限公司；pHS3C型酸度計購自上海雷磁儀器廠；BioRad680型酶聯(lián)檢測儀，MOS 450型圓二色譜儀購自法國BioLogic公司；GWAUN2超純水儀購自北京普析通用儀器有限責任公司；流式細胞儀（FACSAria）購自美國Becton Dikinson公司。 </p><p>　　13細胞活性檢測[6]將對數(shù)生長期HepG2215細胞以 1×105個/孔接種于96孔板，200 μL/孔，置于恒

12、溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，分別加入不同濃度的丹參素和拉米夫定培養(yǎng)基，每個藥物3個平行孔。分別培養(yǎng)24 h 后，每孔加入5 g?L-1 MTT 20 μL，放入培養(yǎng)箱，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸出培養(yǎng)基，每孔加150 μL DMSO，用振蕩器充分振蕩，使結晶充分溶解，用酶標儀測定各孔在 570 nm處的吸光度（A）。根據(jù)A計算，細胞活性=A實驗組/A對照組×100%。 </p><p>　　14流式細胞儀

13、檢測HepG2215細胞內(nèi)ROS[7]將對數(shù)生長期HepG2215細胞以1×105個/孔接種于96孔板中，置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，分別加入5，10，25，50，100 μmol?L-1的丹參素和拉米夫定（10 μmol?L-1）培養(yǎng)基，同時設空白對照，每個藥物3個平行孔。培養(yǎng)48 h后，收集細胞用PBS重新懸浮細胞，首先加入5 μL的FITCAnnexin V避光染色5 min，然后再加入10 μL的PI避光染

14、色15 min，在室溫下避光孵育15 min。取樣后，加入到流式細胞儀，進行熒光強度檢測。 </p><p>　　15丹參素體外抗HBV作用[8]以轉染HBV基因的HepG2215細胞為模型，對丹參素的抗HBV作用進行評價，評價指標為細胞培養(yǎng)上清中的HBsAg，HBeAg，HBV DNA含量。將HepG2215細胞用胰蛋白酶EDTA消化并稀釋成50×104個/mL，接種200 μL于96 孔板中培養(yǎng)。待

15、細胞貼壁后傾去培養(yǎng)基，加入用培養(yǎng)基稀釋成不同濃度的丹參素（5，10，25，50，100 μmol?L-1）和拉米夫定（10 μmol?L-1），同時設空白對照。提取培養(yǎng)上清，用ELISA試劑450 nm處測定培養(yǎng)基中HBsAg和HBeAg吸光度，抑制率=（A空白組-A抑制劑）/A空白組×100%。并用HBV DNA定量PCR試劑測定培養(yǎng)基中HBV DNA濃度。 </p><p>　　16HBV逆轉錄酶活

16、性檢測參照王晨吟等[9]方法，將丹參素和拉米夫定100 μL加入到96 孔培養(yǎng)板中，并加入20 μL含逆轉錄酶的PBS溶液、70 μL的 RT Buffer，在37 ℃水浴1 h后，用洗液清洗3次，除去未結合的游離底物，再向每孔中加入100 μL BSA （1%） 溶液，在室溫下進行30 min的封閉，之后洗板，并再向每孔中加入50 μL的SAALP稀釋液，在37 ℃水浴 1 h后洗板，最后向每孔中加入底物 PNPP（1 g?L-1）5

17、0 μL。在405 nm波長下，利用酶標儀進行測定A，計算酶的抑制率=（A空白對照孔-A實驗孔）/ A空白對照孔×100%。 </p><p>　　17圓二色光譜的測定將不同濃度的丹參素加入到HBV逆轉錄酶的溶液中，混合均勻，以pH 75的磷酸鹽（50 mmol?L-1） 緩沖液做空白，測定樣品在37 ℃下的CD光譜。 </p><p>　　18統(tǒng)計學分析本文采用SPSS 180

18、統(tǒng)計軟件對各組中HepG2215細胞活性、HBV逆轉錄酶抑制率和體外抗HBV作用以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，P<005具有顯著差異性。 </p><p><b>　　2結果與分析 </b></p><p>　　21丹參素對HepG2215細胞生長的抑制作用解析丹參素和拉米夫定對HepG2215細胞生長的半抑制濃度IC50分別為（1535&

19、#177;243），（1165±201） μmol?L-1；丹參素對HepG2215細胞生長的抑制能力與拉米夫定相當，無顯著性差異，見圖1。 </p><p>　　22丹參素誘導HepG2215細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生細胞內(nèi)活性氧水平結果見表1，丹參素能夠提高HepG2215細胞內(nèi)活性氧水平，且呈濃度依賴性升高。加藥組與對照組比較，具有顯著性差異（P<005）。 　　23丹參素的體外抗HBV作用丹參素

20、作用細胞1周后，在一定濃度范圍內(nèi)，都能夠顯著抑制HBsAg和HBeAg表達，其最高抑制率分別為5718%，6234%；同時在10，25，50，100 μmol?L-1濃度下對HBV DNA的合成具有明顯抑制作用，見表2。 </p><p>　　24丹參素對HBV逆轉錄酶活性的抑制作用丹參素對HBV逆轉錄酶的抑制作用見圖2，隨著丹參素濃度的增加，HBV逆轉錄酶的活性呈不斷下降的趨勢，直到丹參素的濃度達到100 μm

21、ol?L-1后，HBV逆轉錄酶的相對活性趨于平緩；解析其半數(shù)抑制濃度（IC50）為（2132±243） μmol?L-1，略高于陽性對照拉米夫定的IC50 （1644±189） μmol?L-1，顯示出丹參素對HBV逆轉錄酶有良好的抑制效果。 </p><p>　　25丹參素對HBV逆轉錄酶二級結構的影響應用在線Dichroweb軟件計算出HBV逆轉錄酶與丹參素結合前后的二級結構含量，結果見表

22、3。從表中可以看出游離HBV逆轉錄酶的α螺旋質(zhì)量分數(shù)為356%，β折疊質(zhì)量分數(shù)為200%，是典型的α螺旋型蛋白類，當向HBV逆轉錄酶中加入丹參素的濃度達到100 μmol?L-1時，α螺旋質(zhì)量分數(shù)增加到485%，β折疊質(zhì)量分數(shù)減小到89%，這表明丹參素會誘導HBV逆轉錄酶構象發(fā)生了部分變化。 </p><p><b>　　3討論 </b></p><p>　　乙型肝炎

23、是嚴重危害人類健康的傳染病，目前尚無根治的特效藥物和方法；眾所周知，逆轉錄酶催化的反應也叫反轉錄 （reverse transcription）。在這個過程中，遺傳信息流HBV逆轉錄酶可以催化逆轉錄過程的發(fā)生，即催化脫氧核糖核苷酸以RNA為模板合成DNA，之后形成一代又一代的DNA，之后HBV雙鏈DNA進行環(huán)化，最終完成HBVDNA的復制[9]，所以基于HBV逆轉錄酶的作用機制，筆者以HBV逆轉錄酶為作用靶點，進行抗乙肝病毒藥物研發(fā)具有

24、重要意義。 </p><p>　　HepG2215細胞是將含有HBV基因組的重組載體質(zhì)粒轉染肝癌HepG2細胞[10]，經(jīng)G418篩選得到的克隆，該細胞能在體外長期培養(yǎng)，并能穩(wěn)定分泌HBsAg，HBeAg及Dane顆粒并產(chǎn)生cccDNA，是目前抗乙肝藥物體外評價最常用的模型[11]；ROS是由細胞內(nèi)氧代謝過程中產(chǎn)生的具有很高生物活性的氧分子[12]。這些氧分子主要由超羥自由基（?OH）、氧陰離子自由基（O-?2）

25、、過氧化氫（H2O2）和單線態(tài)氧（O2）等氧自由基組成[13]。這些氧分子能夠在機體內(nèi)與自身的消化達到動態(tài)平衡，一旦平衡被打破，ROS將促進細胞的快速凋亡[1415]，本研究考察了不同濃度的丹參素對細胞內(nèi)ROS的影響，發(fā)現(xiàn)丹參素可以誘導細胞內(nèi)ROS水平的上升，進而誘導了HepG2215細胞的凋亡。此外，研究表明，丹參素能夠促進HepG2215細胞活性的降低，且能夠顯著的抑制HBsAg，HBeAg的表達和HBV DNA的復制。這意味著，丹

26、參素在細胞水平對HBV抗原的表達和DNA的復制起到抑制作用。 </p><p>　　藥物分子與蛋白的結合勢必會對蛋白的結構造成影響，因此本研究應用了圓二色譜技術，圓二色譜技術以其較高的靈敏度、較好的選擇性、較強的信號水平為酶（蛋白質(zhì)）的二級結構測定提供了一條新的分析途徑。結果表明，丹參素能夠誘導HBV逆轉錄酶的α螺旋含量的增加，使HBV逆轉錄酶的結構變得緊密而不利于酶形成活性中心，致使HBV逆轉錄酶的活力下降[1

27、6]，這可能是丹參素對HBV逆轉錄酶活性抑制的機制。 </p><p><b>　　[參考文獻] </b></p><p>　　[1]李驊，王四旺，張邦樂. 丹參素的藥理活性與藥物動力學研究進展[J]. 西北藥學雜志，2011，26（4）： 310. </p><p>　　[2]王冰瑤，吳曉燕，樊官偉. 丹參素保護心血管系統(tǒng)的藥理作用機制研究進

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