耐爾藍接技超支化合物用于dna電化學傳感器的研究【開題報告】

1、<p><b>　　畢業(yè)論文開題報告</b></p><p><b>　　化學工程與工藝</b></p><p>　　耐爾藍接技超支化合物用于DNA電化學傳感器的研究</p><p>　　一、選題的背景、意義</p><p>　　近年來，人類對基因技術的研究和應用迅速發(fā)展，并在衛(wèi)生防疫、醫(yī)

2、學診斷等領域發(fā)揮重要作用。在多種DNA檢測技術中，DNA生物傳感器代表了一種新的檢測手段，與傳統(tǒng)診斷技術相比，它快速、靈敏、操作和儀器設備簡單，尤其是它具有分子識別功能，在基因診斷、治療，和傳染性疾病檢測等方面做出了很多貢獻，代表了當今生物檢測技術的前沿。正在研究和已經(jīng)應用的DNA傳感器主要包括壓電式傳感器、化學發(fā)光(熒光)傳感器、微組裝免疫傳感器、光學傳感器以及電化學傳感器等。在DNA雜交及識別方面，電化學DNA傳感器成本低，設計簡單

3、，設備小巧，能耗低，引起人們重視[1]。通常，電化學DNA傳感器是通過電極表面同載電化學指示劑標記的ssDNA來識別與之互補的目標DNA序列。所使用的電化學指示劑是具有電化學活性的物質，通常使用二茂鐵，還有鄰苯二胺、陽離子金屬復合物有機染料等。但它們往往同時與ssDNA和dsDNA結合，選擇性不理想。耐爾藍用于生物染色，區(qū)別脂肪酸和中性脂肪，病理組織中細菌和放線菌染色等等方面效果較好，亦有作用為電化學指示劑的實際價值。</p>

4、;<p>　　DNA是一類重要的生命物質，是大多數(shù)生物體遺傳信息的載體，對DNA的研究是生命科學領域中極為重要的內容，隨著人類基因組計劃的順利實施，基于DNA探針的基因傳感器、基因芯片的研究正成為基因組研究的一個熱點，DNA傳感器是用電化學手段選擇性檢測DNA的生物傳感器，由已知的DNA片段和電活性指示劑構成。利用電活性分子（雜交指示劑）來指示雜交前后信號變化，選擇性地識別靶序列[2]。電化學DNA傳感器與通常的標記（放射

5、性同位素標記、熒光標記等）探針技術相比，不僅選擇性好、靈敏度高、響應快、操作簡單及價格低廉，而且有無可比你的分離純化基因的功能，故可望用于臨床快速檢測基因疾病，探討各種因素引起的DNA損傷程度和可能的突變機理以及DNA為作用靶的藥物研究。</p><p>　　二、相關研究的最新成果及動態(tài) </p><p>　　李毓琦[3]等測試了一種新型的乙型肝炎抗體膜片。測試時，僅需將25μl被檢血清滴

6、注于該膜上，經(jīng)孵育與洗滌即可制得抗原與抗體復合物膜。用復合物膜組裝成免疫電極．測定血清樣品中乙型肝炎表面抗原古量。電極的線性范圍是20~320ng/ml，方法的日間相對標準偏差為10.78%(n=4，m=5),對血清中可能存在的一些其它抗原具有較好的選擇性。105例臨床血清樣本，本法與酶聯(lián)免疫吸附分析法測定結果符合率為86%。乙肝抗體膜片系一次性使用，4℃可保存半年以上。</p><p>　　牛淑妍[4]等在0.

7、2mol/L pH5.0 Na-HAc緩沖溶液中，運用電化學方法和熒光光譜分析法研究了硫堇與鮭魚精DNA的相互作用。硫堇與DNA作用后，氧化還原峰電流減小，峰電位正移，溴化乙錠(EB)-DNA體系在加入硫堇后出現(xiàn)熒光淬滅的現(xiàn)象。結果表明，硫堇與DNA的結合方式主要是嵌插作用。以硫堇為電化學雜交指示劑，制得了一種DNA電化學生物傳感器，該傳感器具有良好的選擇性，靶DNA在11.3~121nmol/L范圍內具有了良好的線性關系，線性相關系數(shù)

8、0。9971，檢測限為5.26nmol/L(3σ，n=7)。</p><p>　　劉志敏[5]等以室溫固相合成法制備納米ZnO，通過殼聚糖(CHIT)的成膜效應將納米ZnO固定在玻碳電極(GCE)表面，制得的ZnO/CHIT/GCE電極成為DNA固定和雜交的良好平臺。DNA的固定和雜交通過電化學交流阻抗進行表征。以電化學交流阻抗免標記法檢測目標DNA，固定于電極表面的DNA探針與目標DNA雜交后使電極表面的電子傳

9、遞電阻增大，以此作為檢測信號可以高靈敏度地測定目標DNA。電化學阻抗譜檢測人類免疫缺陷病毒(HIV)基因片段的線性范圍為2.0×10-11～2.0×10-6mol/L，檢出限為2.0× 10-12 mol/L。</p><p>　　魏娜[6]等基于急性早幼粒細胞白血病(acute promyelocytie leukemia，APL)中PML/RARA(promyelocytic l

10、eukemia/retinoic acid receptor alpha)融合基因的堿基序列，設計了一種新型發(fā)夾結構DNA電化學探針，并將此探針固定在玻碳電極表面，采用自行合成的硝基吖啶酮(NAD)作雜交指示劑，應用循環(huán)伏安法與差分脈沖伏安法實現(xiàn)了對人工合成的APL PML／RARA融合基因的檢測，同時對檢測條件進行優(yōu)化。結果表明，在pH 7.0Tris-HCI緩沖液中，雜交前后NAD氧化峰電流差值與靶標鏈濃度在2.0 ×10

11、-8～1.0 ×10-7mol/L范圍內呈良好的線性關系，檢出限為3.0×10-9mol/L。</p><p>　　許世超[7]等構建了一個以亞甲基藍(MB)為雜交指示劑的電化學DNA傳感體系：通過自組裝的方式將巰基改性的單鏈DNA 5’端(HS—ssDNA)連接到金電極表面形成Au—ssDNA，當檢測體系中加入和Au—ssDNA互補的目標單鏈DNA(CSS DNA)時，會形成一個雙鏈DNA系

12、統(tǒng)(Au—dsDNA)，加入MB并通過循環(huán)伏安法檢測了雜交過程中的信號變化，驗證了Au—ssDNA及Au．dsDNA的形成。在4.0×10-6～1.0×10-5moL/L內，檢測靈敏度隨MB濃度的增加而升高，當濃度達到2.0×10-5mol/L時接近最大值。示差脈沖伏安法檢測結果表明，該檢測體系對目標DNA的選擇性識別能力高，可區(qū)分具有單堿基錯配的目標DNA序列。檢測體系對目標DNA的檢測靈敏度隨著目標DN

13、A濃度的增加而增加，在5.0×10-10～1.8×10-9moL/L內呈線性關系，計算所得對目標DNA的檢測限為5.0×10-10moL/L。使用壽命檢測表明，經(jīng)過5次變性/雜交循環(huán)后，檢測信號降低并接近于檢測限。</p><p>　　李金花[8]等研究了DNA夾心雜交和直接雜交體系，將功能化納米金引入到標記有生物素的雜交雙鏈上，制成具有電化學活性和納米金放大作用的DNA電化學傳感器

14、，采用循環(huán)伏安法測試/在夾心雜交體系中，靶點DNA濃度與陽極峰電流關系曲線的相對標準偏差為3.0%~13.0%，在濃度為6.9×10-3~0.14nmol/L范圍內得到良好的線性關系，檢測限達到2.0×10-3nmol/L實現(xiàn)了對單堿基突變的高靈敏檢測和序列識別。直接雜交檢測限為2.5×10-4分別在2.5×10-4~5.0×10-3nmol/L和5.0×10-3~10nmol

15、/L范圍內得到峰電量與濃度的良好線性關系。并比較這兩種體系。</p><p>　　王桂香[9]等用溶膠-凝膠法在玻碳電極上制備了納米多孔羥基磷灰石(Hap)-聚乙烯醇(PVA)涂層膜固定雙鏈DNA，得到了一種新型DNA電化學傳感器，檢測了由Fenton反應引起的DNA氧化性損傷。結果表明，一定量濃度的抗壞血酸(AA)能加速Fenton反應的進行，使DNA損傷很快達到極限；損傷試劑中Fe2+的濃度越大，產(chǎn)生的羥基自

16、由基(OH·)越多，對DNA的損傷就越嚴重；損傷試劑中EDTA的濃度越小，溶液中游離的Fe2+以及與DNA鍵合的Fe2+的濃度則相對越大，對DNA的損傷也就越嚴重。</p><p>　　Lei Yang[10]等通過固定兩種納米ZnO的方法構建了轉移ZnO生物傳感器和增長ZnO生物傳感器。并且系統(tǒng)地研究和比較了不同的生物傳感器之間的性能。增長ZnO生物傳感器的靈敏度高出轉化ZnO生物傳感器52%。相應的

17、，其他性能也是增長ZnO生物傳感器更好一些，包括響應時間，檢測極限和線性范圍。試驗結果和更多葡萄糖氧化酶被固定在原ZnO陣列的實際一致，并有更大的比表面積和更直接的電子通道。</p><p>　　Pauliukaite, Rasa[11]等利用殼聚糖(Chit)薄膜修飾石墨環(huán)氧樹脂復合材料(GrEC)電極用于電化學阻抗譜(EIS)。少量薄膜修飾并使用了不同的交聯(lián)劑：戊二醛(GA)，乙二醛(GO)，表氯醇(ECH)

18、和1-乙基-3-(3-二甲氨基) 碳化二甲基氨(EDC)和亞胺(NHS)在有電活性的鐵氰化鉀(Ⅲ)和氯化hexaammineruthenium(Ⅲ)下一起評估每個的特性。固定碳納米管到殼聚糖模型(Chit-CNT)使用了相同的交聯(lián)劑也同樣進行了研究。電極的阻抗性能與(GrEC/Chit-CNT/EDC-NHS)特性一樣好并被視為安乃近的傳感器和對苯二酚以及為在葡萄糖傳感器殼聚糖模型頂部使用戊二醛固定葡萄糖氧化酶(GOx)。對模型和等效電

19、路進行了分析，并重點對擴散特性和光譜特征進行了討論。</p><p>　　白燕[12]等利用自組裝單分子膜技術將巰己基修飾的單鏈DNA固定在金電極表面，以電活性的Hoechst33258為指示劑，考察了單鏈DNA修飾電極(ssDNA/Au電極)、雙鏈DNA修飾電極(dsDNA/Au電極)的指示劑氧化峰電流，并利用其差值(△ip)與互補DNA濃度成線性關系對待測DNA濃度進行定量。因此，DNA電化學傳感器可用于特定

20、DNA序列的識別和測定。</p><p>　　三、課題的研究內容及擬采取的研究方法（技術路線）、難點及預期達到的目標</p><p><b>　　1、課題的研究內容</b></p><p>　　利用超技化合物中的大量活性基團接枝活性染料，使嵌入DNA的指示劑有更多的電活性基團暴露在外面，在溶液中的電信號會大幅度增強，從而實現(xiàn)超靈敏的電化學檢測目

21、的。探討反應條件，并研究影響測定的干擾因素，建立一種測定特定序列DNA的新方法，</p><p>　　2、擬采取的研究方法、技術路線及研究難點：</p><p>　　2.1 單鏈DNA電化學生物電極的制備；</p><p>　　2.2 研究雜交DNA在電極表面的響應以及嵌入染料-超支化合物在電極表面的電化學信號；</p><p>　　2.3

22、研究實驗的條件改進和電極的優(yōu)化；</p><p>　　2.4 建立一種新型DNA電化學生物傳感器。</p><p><b>　　研究難點：</b></p><p>　　DNA電極的制備與性能研究。</p><p>　　四、論文詳細工作進度和安排</p><p>　　1、2011年3月1日—2011

23、年3月15日：完成資料的檢索和整理及匯總。</p><p>　　2、2011年3月19日—2011年3月23日：完成開題報告及答辯工作。</p><p>　　3、2011年3月26日—2011年5月20日：基本完成論文所需的實驗工作。</p><p>　　4、2011年5月21日—2011年5月30日：完成論文的寫作以及答辯工作。</p><p&

24、gt;<b>　　五、主要參考文獻</b></p><p>　　[1] 崔康. 新型電化學傳感器的研究. 江西師范大學-碩士學位論文.2009</p><p>　　[2] 徐桂云. DNA電化學傳感器的制備及其在轉基因植物產(chǎn)品檢測中的應. 中國海洋大學-博士學位論文.2007</p><p>　　[3] 李毓琦，陳開全，何俊，魏素萱，牟家婉，肖

25、志芳，雷厚成，李明遠. 新型免疫電極法測定乙型肝炎表面抗原．分析化學.1993,2l(2):129-133</p><p>　　[4] 牛淑妍，韓彬. 硫堇與DNA的相互作用及用于DNA電化學傳感器. 青島科技大學學報(自然科學版).2009.30(5):412-414</p><p>　　[5] 劉志敏，李哲建，康寧.基于納米ZnO/殼聚糖復合膜DNA電化學傳感器用于HIV基因的免標記檢

26、測. 分析科學學報.2010.26(1):51-54</p><p>　　[6] 魏娜，陳敬華，王昆，李光文，羅紅斌，蔡婉婷，林新華. 發(fā)夾結構DNA探針用于檢測白血病PML／RARA融合基因的電化學傳感器的研究. 分析測試學報.2008.27(9):907~910</p><p>　　[7] 許世超，張紀梅，姚翠翠，代昭，鄭幗，孫波，佟魏，齊魯. 以亞甲基藍為雜交指示劑的DNA電化學傳感

27、器. 精細化工 2008.25(12):1184-1197</p><p>　　[8] 李金花，胡勁波，丁小勤，李啟隆. 功能化納米金放大的DNA電化學傳感器研究. 高等學?；瘜W學報.2005.26(8):1432-1436</p><p>　　[9] 王桂香，潘芊秀，王懷生. 新型DNA電化學傳感器的研制及其用于DNA氧化性損傷檢測的研究. 高等學?；瘜W學報.2005.26(10):18

28、12~1816</p><p>　　[10] Lei Yang, Yan Xiaoqin , Zhao Jing, Liu Xi, Song Yu, Luo Ning, Zhang Yue. Improved glucose electrochemical biosensor by appropriate immobilization of nano-ZnO. Colloids & Surfaces B:

29、 Biointerfaces.2011.82(1):168-172</p><p>　　[11] Pauliukaite, Rasa. Ghica, Mariana E. Fatibello-Filho, Orlando. Brett, Christopher M.A.Electrochemical impedance studies of chitosan-modified electrodes for app