轉(zhuǎn)基因調(diào)控水稻谷蛋白基因Gt1表達(dá)的研究.pdf

1、稻米是人類的主食,其中的貯藏蛋白易被消化吸收,但蛋白質(zhì)含量較低,賴氨酸含量也缺乏,是稻米蛋白質(zhì)中的第一限制必需氨基酸。所以,提高稻米中的必需氨基酸含量和蛋白質(zhì)含量,平衡其營養(yǎng)品質(zhì),一直是遺傳育種學(xué)家追求的目標(biāo)之一。常規(guī)育種技術(shù)己在鑒別突變體以改良主要糧食作物蛋白質(zhì)營養(yǎng)品質(zhì)等方面獲得了一些進(jìn)展,但在水稻中卻收效甚微。分子生物技術(shù)的發(fā)展為改良稻米種子蛋白質(zhì)營養(yǎng)品質(zhì)提供了一條有效的技術(shù)路線。本研究即是要通過基因工程技術(shù),在水稻種子胚乳中過表達(dá)

2、水稻內(nèi)源谷蛋白以及來自異源植物四棱豆的一個富含賴氨酸的蛋白質(zhì)(Lysine-rich protein,LRP),以提高稻米中的谷蛋白組成以及賴氨酸含量,最終達(dá)到改良稻米營養(yǎng)品質(zhì)的目的。為此,重點開展了兩個方-面的研究工作,包括:(1)水稻貯藏蛋白基因的過表達(dá)以及對水稻蛋白含量的影響。(2)高賴氨酸含量轉(zhuǎn)基因水稻新品系HL1與HL5的表達(dá)分析與分子特征分析。主要研究結(jié)果如下:
　　 第一,為了能用種子胚乳特異性表達(dá)的啟動子來指導(dǎo)目

3、標(biāo)蛋白在轉(zhuǎn)基因水稻種子中高效特異地表達(dá),本研究利用谷蛋白基因Gtl(GluA-2)和醇溶蛋白基因RP5的啟動子連同水稻谷蛋白Gt1(GtuA-2)基因構(gòu)建成嵌合基因,并導(dǎo)入9983與武育粳3號兩個水稻品種中。對轉(zhuǎn)基因水稻中mRNA的表達(dá)以及總蛋白含量分析表明:(1)所有啟動子都能指導(dǎo)Gt1基因在轉(zhuǎn)基因水稻種子的胚乳中轉(zhuǎn)錄,但最終種子總蛋白含量卻無明顯變化,說明通過增加谷蛋白基因的辦法不能提高稻米蛋白的含量;(2)在將Gt1 N-端信號肽

4、編碼序列或?qū)⑵涮鎿Q成醇溶蛋白N-端信號肽編碼序列后,由RP5啟動子引導(dǎo)的Gt1融合基因有明顯的轉(zhuǎn)錄活性,但最終未能篩選到高谷蛋白或低醇溶蛋白轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化事件,信號肽的作用不明顯。(3)為借助于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的雙元載體轉(zhuǎn)化方法培育可剔除抗性選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因水稻,構(gòu)建了含雙T-DNA區(qū)的超雙元載體,證明用超雙元載體法可將外源基因與抗性選擇標(biāo)記基因同時導(dǎo)入并整合到同一個水稻細(xì)胞的基因組中;在由超雙元載體法轉(zhuǎn)化獲得的轉(zhuǎn)基因水稻植株的自交后代中,已篩選獲

5、得了無抗性選擇標(biāo)記基因但含Gt1基因的轉(zhuǎn)基因水稻轉(zhuǎn)化事件。
　　 第二,本實驗室在前期研究中用Gt1基因的啟動子及其5'調(diào)控序列與LRP cDNA構(gòu)建了一個嵌合基因,又采用融合蛋白策略,即將富含賴氨酸的LRP融合進(jìn)水稻谷蛋白Gt1的堿性亞基中,設(shè)計并構(gòu)建了1個Gt1∶∶LRP融合蛋白。將這兩種構(gòu)建都導(dǎo)入了同一個水稻品種9983中,通過篩選,分別獲得了兩個不含有抗性選擇標(biāo)記、高賴氨酸含量轉(zhuǎn)基因水稻新品系HL1與HL5。本研究主要對

6、這兩個新品系進(jìn)行表達(dá)與分子特征分析,主要結(jié)論如下:(1)在Gt1基因啟動子的指導(dǎo)下,LRP與Gt1∶∶LRP融合蛋白都能在轉(zhuǎn)基因水稻種子中高效表達(dá)并穩(wěn)定積累;(3)Gg1∶∶LRP融合蛋白能在轉(zhuǎn)基因水稻種子中正常翻譯,產(chǎn)生預(yù)期分子量大小的融合蛋白;當(dāng)LRP融合進(jìn)谷蛋白的堿性亞基時,只形成單一分子量的融合蛋白,未發(fā)生翻譯后加工等過程。(4)轉(zhuǎn)化事件HL1與HL5都是雙拷貝單插入位點;(5)轉(zhuǎn)化事件HL1的兩個。T-DNA區(qū)為頭尾相連,插入