雞腸道益生菌抗NDV株的篩選及益生菌模擬胃腸條件下的變化研究.pdf

1、新城疫(ND)是禽類的一種高度接觸性、烈性傳染病，給許多國(guó)家的養(yǎng)禽業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。ND的病原為新城疫病毒(NDV)，屬副黏病毒科腮腺炎病毒屬的成員，是一種具有囊膜的RNA病毒，嚴(yán)重地危害著養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展。NDV對(duì)其宿主感染，對(duì)細(xì)胞有絕對(duì)的依存性。眾所周知，病毒對(duì)宿主的致病首先是通過感染宿主細(xì)胞擴(kuò)增其數(shù)量，再借助宿主的循環(huán)系統(tǒng)擴(kuò)散到其他組織來完成的。由此可見，阻止病毒對(duì)宿主細(xì)胞的感染至關(guān)重要。然而，益生菌對(duì)宿主細(xì)胞的保護(hù)作用恰恰就體現(xiàn)

2、在其干擾了病毒對(duì)宿主細(xì)胞的感染過程，對(duì)病毒增殖傳播起到了抑制作用。已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)以細(xì)胞為模型研究益生菌和病毒關(guān)系，其結(jié)果益生菌可以保護(hù)其細(xì)胞完整性。但目前關(guān)于益生菌的研究大多僅限于對(duì)人類病毒研究上，且菌株來源大多為食品類。
　　 本研究目的在于從健康仔雞腸道內(nèi)內(nèi)容物內(nèi)篩選出具有抗NDV活性的益生菌并分析其可能的抗病毒機(jī)制。
　　 實(shí)驗(yàn)中首先運(yùn)用革蘭氏染色、過氧化氫實(shí)驗(yàn)初步篩選出61株益生菌；從中快速篩選出具有降低NDV血

3、凝價(jià)作用的11株菌株；進(jìn)而利用MTT法測(cè)定益生菌處理后的細(xì)胞活性，以及藥敏實(shí)驗(yàn)篩選出對(duì)均高度敏感的抗生素，然后將上述結(jié)果進(jìn)行了細(xì)胞上的益生菌及培養(yǎng)上清抗病毒研究篩選出6株抗病毒效果強(qiáng)的菌株。
　　 在上述基礎(chǔ)上，模擬胃腸道環(huán)境進(jìn)一步檢測(cè)抗病毒效果。具體實(shí)驗(yàn)分組如下：
　　 實(shí)驗(yàn)分為兩個(gè)部分：pH2.0、pH3.0、pH4.0、pH6.4酸性環(huán)境預(yù)處理部分；膽鹽濃度為0.1％、0.2%、0.3%預(yù)處理部分；這兩部分均按下列

4、方法分組測(cè)定。
　　 第1組：益生菌與CEF細(xì)胞預(yù)先分別孵育后再攻毒；第2組：益生菌與病毒同時(shí)接入CEF細(xì)胞；第3組：益生菌對(duì)照；第4組：病毒對(duì)照；第5組：正常CEF細(xì)胞對(duì)照。
　　 結(jié)果顯示：在體外益生菌對(duì)NDV血凝價(jià)影響的實(shí)驗(yàn)中，篩選出的11株益生菌均非常顯著地降低NDV的血凝價(jià)，但菌種間存在差異；其余50株菌株血凝價(jià)略有降低或沒有變化，這一結(jié)果說明益生菌菌株之間有種屬差別；在實(shí)驗(yàn)中對(duì)比選擇的2種致病菌對(duì)NDV的血凝

5、價(jià)均沒有產(chǎn)生影響，說明益生菌可能具有直接影響病毒或其血凝素的作用，并且存在菌種差異。
　　 以MTT法測(cè)定益生菌和NDV處理后的細(xì)胞活性，通過公式計(jì)算病毒抑制率表明，在CEF細(xì)胞上，11株益生菌均有一定抗NDV作用，但是益生菌之間在效果上存在一定的差異性。所以，選擇其中抗病毒效果極顯著的6株菌進(jìn)行了種屬鑒定。并對(duì)其進(jìn)行了生化試驗(yàn)和16SrRNA鑒定，分別命名為MC1、MC19、T4-唾液乳桿菌Lactobacillus sali

6、varius、T6-戊糖乳桿菌Lactobacillus pensus、T12-腸乳桿菌Lactobacillus intestinal、T14-植物乳桿菌Lactobacillusplantarum。
　　 鑒于雞胃腸道環(huán)境變化，實(shí)驗(yàn)分別模擬研究了益生菌活菌和培養(yǎng)上清在不同pH值、不同膽鹽情況下的抗病毒效果，結(jié)果表明，隨著pH值的降低抗病毒的抑制率也降低；這可能的原因是其低pH值下菌株活菌數(shù)也隨之降低，濃度和稀釋度都有所下降，

7、這說明益生菌對(duì)NDV發(fā)揮作用是具有極顯著的量效關(guān)系；盡管益生菌隨著膽鹽濃度的升高其變化幅度很小，但也表現(xiàn)為隨著膽鹽濃度升高其病毒抑制率也隨之降低。說明腸道內(nèi)膽鹽濃度可能對(duì)益生菌本身影響很小，并不影響發(fā)揮其抗病作用；或者膽鹽可能刺激細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。益生菌先接入細(xì)胞后攻毒與益生菌與病毒同時(shí)接入細(xì)胞均對(duì)NDV病毒有抑制作用。提示，益生菌可能對(duì)NDV結(jié)構(gòu)具有直接破壞作用或者吸附病毒作用，干擾NDV感染。
　　 綜上所述，本文篩選出的M