堿性成纖維細胞生長因子對不同日齡大鼠癲疒間持續(xù)狀態(tài)后海馬神經(jīng)發(fā)生的影響

1、<p>　　堿性成纖維細胞生長因子對不同日齡大鼠癲疒間持續(xù)狀態(tài)后海馬神經(jīng)發(fā)生的影響</p><p>　　作者：戴園園 袁寶強 魏海燕 </p><p>　　【摘要】 目的 了解不同年齡大鼠癲疒間持續(xù)狀態(tài)后外源性堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)對海馬齒狀回顆粒細胞層神經(jīng)發(fā)生的影響。方法 建立14天大鼠和60天大鼠戊四氮(PTZ)誘導癲疒間持續(xù)狀態(tài)模型,生理鹽水（NS）注射作為對

2、照，皮下注射bFGF進行干預，分4組：NS組、NS+ bFGF組 、PTZ組、PTZ+ bFGF組。采用Brdu標記新生細胞，免疫組化方法檢測造模后大鼠海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生情況，造模后第7、14天2個時間點觀察海馬齒狀回Brdu陽性細胞數(shù)。結果 造模后第7天和14天,PTZ組中各日齡組大鼠海馬齒狀回Brdu陽性細胞數(shù)明顯高于各自對應的NS組(P&lt;0.01),NS+bFGF組各日齡大鼠Brdu陽性細胞數(shù)亦高于NS組(P&

3、;lt;0.05), PTZ+bFGF組Brdu免疫陽性細胞數(shù)較PTZ組亦有升高(14天日齡組P&lt;0.05,60天日齡組P&lt;0.01)。60天大鼠較14天大鼠升高幅度更為明顯(P&lt;0.01)。結論 bFGF可增加癲疒間持續(xù)狀態(tài)大鼠海馬齒狀回顆粒細胞發(fā)生,對60日齡大鼠比14日齡幼鼠更為明顯。 </p><p>　　【關鍵詞】 癲疒間持續(xù)狀態(tài) 堿性成纖維細胞生長因子 神

4、經(jīng)發(fā)生 齒狀回 </p><p>　　Abstract: Objective To study the neurogenesis of hippocampal dentate gyrus granular cell layer in different-age rats with induced status epilepticus and its response to ectogenic basic fi

5、broblast growth factor (bFGF). Methods Pentetrazole (PTZ) was used to form status epilepticus model on 14-day and 60-day old rats. The experiment was carried out in four groups, with the results analysed 7 days and 14

6、days after treatment. Brdu labeled new cells were counted to describe the neurogenesis in d</p><p>　　Key words: status epilepticus; basic fibroblast growth factor; neurogenesis; dentate gyrus </p>&l

7、t;p>　　癲疒間是神經(jīng)系統(tǒng)常見疾患，發(fā)作后海馬齒狀回可發(fā)生多種可塑性變化，包括軸索重組、星形膠質(zhì)細胞活化、樹突重組和顆粒細胞的神經(jīng)發(fā)生(neurogenesis)等。神經(jīng)發(fā)生是指包括人在內(nèi)的大多數(shù)哺乳類動物均存在的神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生新神經(jīng)元的過程。近年來，已有研究證實癲疒間發(fā)作后海馬齒狀回顆粒細胞層的神經(jīng)發(fā)生增加［1－2］。海馬齒狀回顆粒細胞層的神經(jīng)發(fā)生受到多種生長因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子的調(diào)控，其中堿性成纖維細胞生長因子(basic fi

8、broblast growth factor, bFGF)是較重要的一種。本試驗即給予外源性bFGF皮下注射，探討bFGF是否促進大鼠癲疒間發(fā)作后海馬齒狀回顆粒細胞層神經(jīng)發(fā)生，并探討年齡因素對于癲疒間發(fā)作后這一可塑性變化有無影響。 </p><p><b>　　1 材料和方法 </b></p><p>　　1.1 動物及分組 生后14天和60天的SD大鼠 ，分別

9、隨機分為癲疒間持續(xù)狀態(tài)組（PTZ組）、 生理鹽水組（NS組）、 bFGF干預癲疒間持續(xù)狀態(tài)組（PTZ+ bFGF）和bFGF干預生理鹽水組（NS+ bFGF組）。 </p><p>　　1.2 模型的建立 PTZ組和PTZ+ bFGF組給予腹腔內(nèi)注射1％戊四氮(PTZ，Sigma公司) 80 mg/kg, 用雙蒸水稀釋成10 g/L,腹腔注射；NS組、NS+ bFGF組給予腹腔注射等體積生理鹽水。NS+ bF

10、GF組和PTZ+ bFGF組在注射戊四氮或生理鹽水前2 h皮下注射bFGF（Sigma公司）20 μg/kg （用生理鹽水稀釋成1 mg/L）。PTZ組和PTZ+bFGF組中除去無發(fā)作和死亡者，每組入組6只。 </p><p>　　參照Racine癲疒間發(fā)作分級標準［3］:0級,無任何發(fā)作;1級,口、面部抽搐;2級,節(jié)律性點頭樣運動;3級,前肢陣攣;4級,前肢陣攣伴后肢站立;5級,反復的4級發(fā)作或抽搐致死。PTZ

11、組和PTZ+ bFGF組入組大鼠均達到3~5級發(fā)作，持續(xù)30 min以上，發(fā)作間期意識無清醒，呈癲疒間持續(xù)狀態(tài)。發(fā)作1 h以上者給予地西泮4 mg/kg腹腔注射中止發(fā)作。 </p><p>　　1.3 Brdu注射 Brdu（Sigma公司）溶于生理鹽水，濃度10 g/L。注射戊四氮或生理鹽水后第6、13天各組經(jīng)腹腔注射Brdu，劑量為50 mg/kg,每2 h 1次，共4次。 </p><

12、;p>　　1.4 組織切片制備 各組分別于注射Brdu后24 h腹腔注射10％水合氯醛（0.35 ml/kg）麻醉。生理鹽水快速灌注后，含4％多聚甲醛的PBS先快速灌注再緩慢灌注，直到大鼠肝臟變白、尾變硬,停止灌注。開顱,取嗅腦至中腦之間的腦組織,放入4%多聚甲醛固定12 h以上,然后依次移入20%和30%蔗糖中4℃過夜至沉底。在海馬部位做冠狀冰凍切片,每隔2張取1張切片,每例標本(雙側(cè)海馬結構)取切片不少于8張,進行免疫組化

13、染色。 </p><p>　　1.5 Brdu免疫組化 應用SP免疫組化試劑盒（北京中杉金橋生物公司）, 按以下步驟處理:腦片入新配制的0.1%H2O2溶液中室溫下孵育30 min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶; 入2 mol/L HCl溶液中，37℃ 浸泡60 min使DNA變性，再用0.1 mol/L硼酸緩沖液(pH 8.5)室溫下浸泡10 min用以中和鹽酸；然后以鼠抗尿嘧啶脫氧核苷單克隆抗體（1∶100，北京

14、中杉金橋生物公司）作為一抗， 采用SP法行Brdu免疫組織化學染色， 用DAB和H2O2 呈色， 自來水沖洗， 貼片、 脫水、 透明、 封片。 胞核棕黃色為陽性細胞。 </p><p>　　1.6 圖像分析 切片置于Olympus PM-CB顯微鏡下觀察,在高倍鏡下觀察整片大鼠海馬齒狀回顆粒細胞層(GCL)、亞顆粒增生帶(SGZ,CL與門區(qū)之間約2個細胞體厚的1層)及門區(qū)的Brdu陽性細胞數(shù),每只大鼠隨機取5

15、~6個非連續(xù)腦片進行計數(shù)，取平均值。 </p><p>　　1.7 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)由SPSS 11.5統(tǒng)計軟件處理，x±s表示，組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）及t檢驗，檢驗水準：α=0.05。 </p><p><b>　　2 結 果 </b></p><p>　　2.1 行為學觀察 PTZ組、PTZ+bFGF

16、組：注射戊四氮后經(jīng)過1～4 min的潛伏期，大鼠由自由活動狀態(tài)逐漸轉(zhuǎn)為安靜，眼神呆滯，出現(xiàn)咀嚼運動、流涎、扒地、搔抓動作，雙后肢分開站立，繼之進入大發(fā)作期，出現(xiàn)前肢痙攣、狂奔，跳躍、嘶叫、頭偏向一側(cè)及全身陣發(fā)性抽動；部分動物表現(xiàn)為摔倒、翻滾等全身強直－陣攣性發(fā)作，同時伴有喉鳴、肢端青紫等。入組動物發(fā)作均超過30 min，發(fā)作超過1 h者經(jīng)注射地西泮后逐漸緩解。發(fā)作停止后，動物經(jīng)約1 h安靜狀態(tài)后活動漸恢復。 </p>&l

17、t;p>　　NS組、NS+bFGF組：無任何發(fā)作跡象和抽搐表現(xiàn)，行為正常。 </p><p>　　2.2 堿性成纖維細胞生長因子對海馬神經(jīng)發(fā)生的影響 造模后第7天和第14天，2個日齡組中NS+bFGF組Brdu陽性細胞數(shù)較各自NS組增多（P&lt;0.05），PTZ各組日齡的大鼠Brdu陽性細胞數(shù)明顯高于各自的NS組（P&lt;0.05），同時PTZ+bFGF組較PTZ組亦明顯升高（P&

18、amp;lt;0.05）。 </p><p>　　造模后第7天，4組大鼠的大部分Brdu陽性細胞分布于顆粒細胞下層(圖1A、C)；第14天，新生細胞在PTZ組和PTZ+bFGF組除分布于顆粒細胞層外，另有一部分遷移到門區(qū)和內(nèi)分子層（圖1B、D）。而在NS組和NS+bFGF組，Brdu陽性細胞主要分布于整個顆粒細胞層（圖1E）。 </p><p>　　新生細胞在由顆粒下層向顆粒細胞層遷移的

19、</p><p>　　過程中， 胞核變大， 形狀更接近圓形或卵圓形（圖1F）。 </p><p>　　圖1 大鼠海馬齒狀回Brdu免疫反應產(chǎn)物(SP法) </p><p>　　A：PTZ組發(fā)作后7天，Brdu陽性細胞大部分分布在顆粒細胞下層（×100）； B： PTZ組發(fā)作后14天, Brdu陽性細胞除大部分布于顆粒細胞層外，還有部分分布在門區(qū)和內(nèi)分子層

20、（×100）；C：PTZ+ bFGF組處理后7天，Brdu陽性細胞大部分分布在顆粒細胞下層（×100）；D：PTZ+ bFGF組處理后14天，Brdu陽性細胞除大部分布于顆粒細胞層外，仍有部分分布在門區(qū)和內(nèi)分子層（×100）；E： NS+bFGF組處理后14天, Brdu陽性細胞主要分布于整個顆粒細胞層（×100）；F：Brdu陽性細胞（×400）。表1 不同日齡大鼠各組齒狀回Brdu

21、陽性細胞數(shù)比較 </p><p><b>　　3 討 論 </b></p><p>　　1992年，Reynold和Weiss證明成年哺乳動物的大腦內(nèi)存在有神經(jīng)發(fā)生現(xiàn)象［2］，主要部位在側(cè)腦室下區(qū)和海馬，海馬齒狀回下顆粒層增生帶的祖細胞可以在細胞層和門區(qū)的邊界增殖后遷移到顆粒細胞層并分化為成熟神經(jīng)元。在動物實驗中, 化學致驚劑誘導的顳葉癲疒間或是癲疒間持續(xù)狀態(tài)所致

22、的齒狀回細胞增殖至少要經(jīng)過數(shù)天的潛伏期，而神經(jīng)元發(fā)生的高峰通常在癲疒間發(fā)作后1周左右［4］。我們前期的實驗已證明幼鼠癲疒間持續(xù)狀態(tài)后海馬齒狀回細胞有顯著的神經(jīng)發(fā)生現(xiàn)象，這種神經(jīng)元生成增加提示在損傷部位可能有代償作用［5］。 </p><p>　　神經(jīng)細胞的增殖和新生神經(jīng)元的存活受到許多因素的影響,包括年齡、激素水平及多種生長因子等。其中bFGF對于腦損傷后的修復作用正受到越多學者的關注。 bFGF長期以來一直被認

23、為是一種神經(jīng)膠質(zhì)細胞有效的有絲分裂原，能改善神經(jīng)細胞的生長過程， bFGF可以改善海馬結構、腦皮質(zhì)、小腦的顆粒層神經(jīng)細胞的存活和生長。在正常狀態(tài)下,海馬有一定的bFGF基礎表達，癲疒間發(fā)作后腦內(nèi)海馬區(qū)bFGF表達顯著增加［6］，提示中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷局部環(huán)境存在自我修復，但這種因素短暫而不穩(wěn)定。體內(nèi)bFGF含量極微，病理情況下，內(nèi)源性bFGF作用有限，外源性bFGF可以及時補充內(nèi)源性bFGF的不足，早期應用可限制神經(jīng)元損害的擴大。體內(nèi)外實

24、驗證明，bFGF可以通過血腦屏障進入神經(jīng)系統(tǒng)［7］,并且 bFGF在生物進化上有很強的保守性，人和牛bFGF氨基酸順序同源性達98.7％，這為臨床利用外源性bFGF進行替代補充治療提供了基本依據(jù)。 </p><p>　　有實驗顯示，在胎兒海馬C3區(qū)移植物進行移植替代癲疒間持續(xù)狀態(tài)后丟失的神經(jīng)元時，經(jīng)過bFGF預處理的細胞存活時間延長，且和成年海馬顯示出較好的整合作用并減輕了異常的苔蘚纖維發(fā)芽［8］ 。Zucchi

25、ni等［9］應用紅藻氨酸點燃模型發(fā)現(xiàn)小鼠癲疒間發(fā)作后bFGF mRNA和蛋白的水平在某些腦區(qū)升高，給予側(cè)腦室注射低劑量bFGF可以減輕海馬的損傷,促進行為的恢復。 </p><p>　　本實驗對大鼠年齡的選擇基于人腦和大鼠腦發(fā)育程度的對應關系。普遍認為:14天大鼠的腦發(fā)育程度與1歲兒童相當,而生后60天鼠腦的發(fā)育基本成熟。 雖然齒狀回的神經(jīng)干細胞具有終身分化的能力，但隨著年齡的增加，細胞的增殖能力減弱。本實驗亦顯

26、示，NS組中14天幼鼠海馬的神經(jīng)發(fā)生現(xiàn)象較60天大鼠顯著，bFGF對14天幼鼠和60天成年大鼠海馬齒狀回顆粒細胞層的神經(jīng)發(fā)生均有促進作用，但對60天大鼠促進作用更明顯。在癲疒間發(fā)作大鼠組中， bFGF干預后1周后，14天大鼠的海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生較PTZ組增加了7％，而60天大鼠則增加了20％。這一結果顯示成熟大腦對于bFGF的促神經(jīng)發(fā)生作用有著更高的敏感性。Jin等［10］ 的實驗發(fā)現(xiàn)，給予注射bFGF后，20個月的小鼠SGZ區(qū)Brdu

27、陽性細胞數(shù)增加了250％，說明年老的大腦對外源性bFGF仍有著非常敏感的反應。據(jù)研究，大鼠出生2周內(nèi)腦內(nèi)bFGF較低，僅為成鼠的20％［11］，故而推測14天幼鼠腦內(nèi)bFGF受體亦未發(fā)育完全或受體數(shù)量相對較少而造成這種差異。具體機制尚待進一步探討。 </p><p>　　bFGF 促進大鼠海馬齒狀回的神經(jīng)發(fā)生機制尚不十分明確,可能和以下有關:bFGF 誘導及促進神經(jīng)前體細胞細胞核有絲分裂［12］,調(diào)節(jié)神經(jīng)元前體細

28、胞端粒酶活性［13］,調(diào)控鈣調(diào)蛋白基因、血小板凝血酶敏感蛋白1 基因、特異性成骨細胞因子2 基因和細胞因子誘導的核蛋白的表達［14］。 </p><p>　　癲疒間發(fā)作后存在神經(jīng)細胞丟失，嚴重癲疒間發(fā)作后腦部的病理損害可累及多個腦區(qū)，其中海馬區(qū)的細胞減少密度最為明顯，損傷區(qū)周圍的星形膠質(zhì)細胞被激活，能夠產(chǎn)生包括bFGF在內(nèi)的各種細胞生長因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子，有利于神經(jīng)元的生存和軸突再生，但保護作用是有限的。當腦損傷

29、較重，或損傷時間長，保護作用則相對較弱。我們的實驗采用了癲疒間持續(xù)狀態(tài)模型，雖然癲疒間大鼠發(fā)作后神經(jīng)元增殖增加，但仍遜于bFGF干預的癲疒間大鼠，這就提示內(nèi)源性bFGF等因素所致的增殖代償能力是有限的。外源性加入bFGF改變細胞再生環(huán)境，調(diào)控星形膠質(zhì)細胞至一個恰當?shù)臓顟B(tài)，創(chuàng)造出一個有利于神經(jīng)功能恢復的微環(huán)境。 </p><p>　　嚴重的癲疒間發(fā)作會出現(xiàn)認知功能障礙，尤其在兒童，而神經(jīng)發(fā)生現(xiàn)象和空間的學習、記憶能

30、力有密切關系。bFGF在腦損傷后是一種極其重要的調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)發(fā)生的因子。在腦損傷后給予外源性生長因子可以提供一個治療方面的策略。 </p><p><b>　　【參考文獻】 </b></p><p>　　［1］ Parent JM. Injury-induced neurogenesis in the adult mammalian brain［Ｊ］. Neurosc

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