腺苷酸激酶2(AK2)在棉鈴蟲生長(zhǎng)發(fā)育中的功能.pdf

1、研究背景及研究意義：
　　 棉鈴蟲（Helicoverpaarmigera）是一種全變態(tài)昆蟲，屬于鱗翅目夜蛾科。由于棉鈴蟲生長(zhǎng)周期相對(duì)較短并且易于人工飼養(yǎng)，已漸漸成為研究昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育的重要實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。棉鈴蟲還是重要的農(nóng)業(yè)害蟲，危害棉花、玉米等數(shù)十種農(nóng)作物，發(fā)現(xiàn)調(diào)控棉鈴蟲生長(zhǎng)發(fā)育的重要基因?qū)τ诳刂泼掴徬x具有理論指導(dǎo)意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值。
　　 生物學(xué)功能需要能量保障，昆蟲發(fā)育也不例外。腺苷酸激酶(AdenylateKinas

2、es，AK)是一種調(diào)控細(xì)胞內(nèi)能量轉(zhuǎn)換的磷酸轉(zhuǎn)移激酶，主要催化:2ADP(GDP)(←→)ATP(GTP)+AMP，維持細(xì)胞內(nèi)的能量平衡，對(duì)生物體的生長(zhǎng)發(fā)育中具有重要作用。AK生物學(xué)功能涉及到依賴能量的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，激素的分泌，細(xì)胞和纖毛的運(yùn)動(dòng)，核運(yùn)輸過(guò)程和DNA的合成與修復(fù)等生理功能。AK2屬于AK家族的一員，具有AK家族的磷酸轉(zhuǎn)移酶活性。本文主要研究與能量代謝密切相關(guān)的激酶AK2在昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育中的功能。通過(guò)該項(xiàng)研究，發(fā)現(xiàn)調(diào)控棉鈴蟲生長(zhǎng)

3、發(fā)育的重要基因，為害蟲控制提供理論依據(jù)和靶標(biāo)基因。
　　 國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展及存在的科學(xué)問(wèn)題
　　 對(duì)脊椎動(dòng)物研究表明AK2調(diào)控細(xì)胞增殖，敲除斑馬魚AK2導(dǎo)致白細(xì)胞異常發(fā)育;同時(shí)人類AK2突變或缺失會(huì)影響造血前體細(xì)胞的增殖和分化，引起嚴(yán)重的造血障礙疾病，說(shuō)明AK2是細(xì)胞增殖和分化必需。但也有研究表明AK2參與線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程。因此AK2的功能還不確定。在昆蟲中對(duì)AK2的研究主要集中在果蠅中，果蠅AK2純和突變體幼蟲生

4、長(zhǎng)受到抑制并在到達(dá)3齡前死亡，說(shuō)明AK2是昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育必需的。但是AK2調(diào)控昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育的分子機(jī)理還不清楚。
　　 研究結(jié)果：
　　 基于以上科學(xué)問(wèn)題，本文通過(guò)基因克隆、蛋白重組表達(dá)和多克隆抗體制備、Westernblot、MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、免疫細(xì)胞化學(xué)、RNAi、RT-PCR等實(shí)驗(yàn)方法研究了AK2的功能及可能的分子機(jī)理。
　　 我們首先克隆得到棉鈴蟲AK2基因的全長(zhǎng)序列，并進(jìn)行序列分析發(fā)現(xiàn)AK2是一個(gè)在不同物

5、種中高度保守的基因。為了研究AK2在棉鈴蟲生長(zhǎng)發(fā)育中的功能，我們用Westernblot實(shí)驗(yàn)技術(shù)研究了AK2在棉鈴蟲發(fā)育階段的表達(dá)模式，結(jié)果顯示AK2在各組織中均有表達(dá)，并且在發(fā)育階段呈現(xiàn)持家表達(dá)模式，暗示AK2是棉鈴蟲生長(zhǎng)發(fā)育所必需的基因。對(duì)AK2亞細(xì)胞定位研究表明AK2定位在線粒體上，說(shuō)明AK2在能量代謝中具有重要作用。為了研究AK2對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，我們通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)將大腸桿菌中重組表達(dá)的AK2蛋白與棉鈴蟲表皮細(xì)胞共孵育，發(fā)現(xiàn)AK

6、2能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖。為了進(jìn)一步研究AK2在棉鈴蟲生長(zhǎng)發(fā)育中的功能，我們通過(guò)RNAi技術(shù)干擾掉蟲體的AK2基因，發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲的生長(zhǎng)受到了抑制包括體重下降，發(fā)育延遲以及血細(xì)胞數(shù)量下降。同時(shí)通過(guò)RT-PCR檢測(cè)一些與棉鈴蟲生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的基因如蛻皮激素受體EcRB1，轉(zhuǎn)錄因子USP1和Broad以及蛋白激酶AKT轉(zhuǎn)錄水平的變化，結(jié)果顯示AK2的缺失抑制這些基因的轉(zhuǎn)錄。
　　 結(jié)論及意義：
　　 通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們得到以下結(jié)論:A