日本落葉松實(shí)生苗small RNA測(cè)序、microRNA鑒定及其目標(biāo)基因差異表達(dá)分析.pdf

1、日本落葉松(Larix leptolepis)是我國(guó)北方重要的針葉速生用材造林樹(shù)種，已經(jīng)在選擇育種和雜交育種等方面取得重要進(jìn)展，然而仍不能滿足發(fā)展林木良種、提高林木產(chǎn)量、增強(qiáng)落葉松生產(chǎn)力的重大需求。究其原因，除背景復(fù)雜、生長(zhǎng)周期長(zhǎng)等特有問(wèn)題外，我國(guó)針葉樹(shù)基礎(chǔ)理論與分子遺傳研究基礎(chǔ)薄弱也是導(dǎo)致落葉松改良進(jìn)程緩慢的原因之一。新型的microRNA(miRNA)在生物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用，是農(nóng)藝性狀關(guān)鍵調(diào)控因子，正作為手段運(yùn)用于品種

2、遺傳改良研究。本研究以2年生日本落葉松實(shí)生苗根、莖、葉總RNA等量混合樣品構(gòu)建small RNA(sRNA)文庫(kù)，利用Solexa測(cè)序平臺(tái)，結(jié)合生物信息學(xué)方法篩選調(diào)控落葉松生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的miRNAs；通過(guò)psRNATarget軟件在線預(yù)測(cè)miRNAs目標(biāo)基因；采用qRT-PCR技術(shù)研究種子萌發(fā)不同時(shí)期的種胚(0 d、1 d、5 d、9 d、28 d)、植株生長(zhǎng)不同時(shí)期的針葉及莖(90 d、1.5 a、5 a、10 a、25 a和50 a

3、)中miRNA的差異表達(dá)及5′RACE技術(shù)驗(yàn)證3個(gè)目標(biāo)基因的切割位點(diǎn)。研究結(jié)果如下：
　　(1)利用Illumina GAIIx平臺(tái)進(jìn)行sRNA庫(kù)Solexa測(cè)序并篩選出候選miRNAs。獲得27,042,027條原始序列，經(jīng)去噪、除雜，獲得長(zhǎng)度范圍在16nt～26nt的待分析序列7,466,370條，測(cè)序數(shù)據(jù)已提交至NCBI-Gene Expression Omnibus(GEO)數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為GSE34805。21 nt長(zhǎng)度

4、的序列占sRNA的48.39％，表明落葉松sRNA以21 nt長(zhǎng)度序列為主要類(lèi)型；將待分析序列與miRBase(17.0)及本室落葉松轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行BLAST序列比對(duì)，獲得308個(gè)候選miRNAs。Solexa技術(shù)成功獲得大量針葉樹(shù)候選miRNAs序列。
　　(2)利用BLAST比對(duì)及二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)鑒定出85個(gè)家族的174個(gè)miRNAs。77個(gè)miRNAs(61.04%為21 nt；66.23%以U為5′端首位堿基)屬于48個(gè)保守家

5、族，占所鑒定的miRNA基因家族總數(shù)的56.47%；97個(gè)miRNAs屬于37個(gè)新發(fā)現(xiàn)的基因家族(74.23%為21 nt；48.45%以U為5′端首位堿基)。48個(gè)保守miRNAs基因中有20個(gè)是陸地植物共同保守的(miR156、miR159、miR160、miR162、miR164、miR166～miR169、miR171、miR172、miR390、miR393～miR399和miR408)，12個(gè)miRNAs僅在針葉樹(shù)種中特異表

6、達(dá)(miR946、miR947、miR950、miR951、miR1311～miR1314、miR1316、miR3697、miR3701和miR3707)。利用qRT-PCR方法對(duì)34個(gè)保守的和6個(gè)新發(fā)現(xiàn)的miRNAs進(jìn)行了表達(dá)驗(yàn)證。研究發(fā)現(xiàn)和鑒定的miRNA基因，拓寬了我們對(duì)針葉樹(shù)miRNA的認(rèn)識(shí)并極大地豐富了其信息資源。
　　(3)利用生物信息學(xué)手段預(yù)測(cè)、分析出236個(gè)miRNA目標(biāo)基因。psRNATarget軟件預(yù)測(cè)目標(biāo)基

7、因及GO蛋白功能注釋結(jié)果表明，日本落葉松85個(gè)miRNA基因家族的236個(gè)目標(biāo)基因主要參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、生長(zhǎng)發(fā)育、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、脅迫響應(yīng)、激素信號(hào)傳導(dǎo)及電子傳遞等生物過(guò)程。
　　(4)29個(gè)miRNAs在種子萌發(fā)前期總體呈下降趨勢(shì)、8個(gè)miRNAs在植株生長(zhǎng)過(guò)程中隨植株年齡增加呈規(guī)律性表達(dá)變化模式。運(yùn)用qRT-PCR方法分析了miR156等29個(gè)miRNAs在日本落葉松種子萌發(fā)過(guò)程5個(gè)關(guān)鍵時(shí)期(0 d、1 d、5 d、9 d和28 d)和

8、植株生長(zhǎng)6個(gè)時(shí)期(90d、1.5a、5a、10a、25a和50a)的表達(dá)變化模式。結(jié)果顯示，miRNAs的表達(dá)水平在成熟種子(0d)中最高，吸脹(1d)和萌動(dòng)(5d)階段迅速下降，44.83%(13/29)的miRNAs總體呈逐漸降低趨勢(shì)；種子萌發(fā)各個(gè)時(shí)期，miR894的相對(duì)表達(dá)量最高，miR408最低。8個(gè)miRNAs(miR156、miR172、miR395、miR396、miR397、miR398、miR408和miR947)隨年

9、齡增長(zhǎng)呈現(xiàn)出規(guī)律性上升或下降趨勢(shì)。5a和25a是許多miRNAs表達(dá)變化的轉(zhuǎn)折點(diǎn)，可能是miRNA調(diào)控落葉松生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期。研究揭示了在種子萌發(fā)和植株生長(zhǎng)過(guò)程中，miRNAs的差異表達(dá)特性可能對(duì)落葉松生長(zhǎng)發(fā)育起著重要調(diào)控作用。
　　(5) APm、EF1和eIF三個(gè)適合目標(biāo)基因qRT-PCR定量研究的內(nèi)參基因的篩選。利用geNorm和NormFinder兩種分析軟件對(duì)12個(gè)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)，并從中篩選出在落葉松不同

10、器官、不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期（體細(xì)胞胚胎原胚團(tuán)時(shí)期到胚胎成熟時(shí)期、種子萌發(fā)過(guò)程、植株幼年生長(zhǎng)階段到成年生長(zhǎng)階段）表達(dá)穩(wěn)定的APm、EF1和eIF三個(gè)內(nèi)參基因。為落葉松miRNA目標(biāo)基因的qRT-PCR表達(dá)分析提供最適內(nèi)參。
　　(6)落葉松針葉中miR172與其目標(biāo)基因AP2L1的表達(dá)變化在植株生長(zhǎng)過(guò)程中呈顯著負(fù)調(diào)控關(guān)系(r＝–0.960，P=0.002)。miR172、miR397和 miR398分別切割其目標(biāo)基因AP2L1、JR14

11、7962(Laccase)和 JR143920(Phytocyanin)的mRNA，切割位點(diǎn)位于 miRNA與其目標(biāo)基因互補(bǔ)序列第10和11位堿基之間。miR397、miR398與其目標(biāo)基因JR147962(Laccase)、JR143920(Phytocyanin)之間的表達(dá)變化未發(fā)現(xiàn)明顯相關(guān)性。
　　上述研究表明，來(lái)自85個(gè)家族的174個(gè)miRNAs中，有8個(gè)miRNAs在落葉松的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中可能具有重要調(diào)控作用。miR17