萊克多巴胺單克隆抗體免疫檢測試劑的研制和應用.pdf

1、萊克多巴胺（Ractopamine，RCT）是一種β腎上腺素能興奮劑，具有營養(yǎng)再分配、促進蛋白質合成的作用。萊克多巴胺可能被非法作為動物飼料添加劑，以提高飼料轉化率和增加瘦肉率，但其殘留對人類健康存在潛在的危害。本研究旨在制備特異性針對萊克多巴胺的單克隆抗體，并建立競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗(ciELISA)和免疫膠體金試紙條用于萊克多巴胺殘留的檢測。
　　 采用混合酸酐法將萊克多巴胺與匙孔藍蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)

2、，經紫外光譜掃描確定偶聯(lián)成功，測得偶聯(lián)物RCT-KLH濃度為3.6mg/mL，RCT-BSA濃度為6.2mg/mL。以偶聯(lián)物RCT-KLH作為免疫原，免疫6-8周齡雌性BALB/c小鼠，取小鼠脾細胞和骨髓瘤細胞SP2/0-Ag-14進行融合。以RCT-BSA作為包被抗原，經間接ELISA篩選出陽性細胞株，再用有限稀釋法進行多次亞克隆，獲得穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞10株，分別為1D9、1F3、2Cll、5C3、3A10、4A8、68

3、7、6D5、7Cll、7D3，其中單克隆抗體5C3和3A10間接ELISA效價均為1:500000。間接競爭ELISA顯示，單克隆抗體5C3對萊克多巴胺的50％阻斷作用濃度(ICso)為3.98ng/mL，對鹽酸克倫特羅和沙丁胺醇的IC50均大于2000ng/mL;對鹽酸克倫特羅和沙丁胺醇的交叉反應率均小于0.2％。
　　 以單克隆抗體5C3為核心試劑，建立了間接競爭ELISA檢測萊克多巴胺的方法，并研制出ELISA試劑盒，以混

4、合酸酐法人工合成的萊克多巴胺-卵清蛋白(RCT-OVA)為包被抗原，萊克多巴胺為競爭的半抗原，兩者與一定量的抗萊克多巴胺單克隆抗體5C3在競爭體系中反應。試驗結果表明，包被抗原的最佳稀釋濃度為1:1600，抗萊克多巴胺單克隆抗體5C3工作濃度為1:8000，包被抗原37℃包被3h為最佳包被條件。間接競爭ELISA檢測萊克多巴胺標準品檢測線性范圍為0.5～100ng/mL，最低檢測限為0.5ng/mL，標準曲線的相關系數(shù)(R2)達到0.9

5、968。試劑盒的樣品檢測離散系數(shù)(CV)不高于3.4％，陽性添加回收率平均達到99.2％。對豬飼料、肝臟、尿液樣品，ELISA試劑盒的檢測限分別為0.01mg/kg、0.01mg/kg和0.5ng/mL。經廈門出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心、四川出入境檢驗檢疫局、南通市畜產品質量檢驗測試中心和南京市棲霞區(qū)畜牧獸醫(yī)站等四家單位對人工添加菜克多巴胺樣品進行檢測，結果顯示當樣品中萊克多巴胺濃度>0.5ng/mL時，本研究中研制的ELISA檢

6、測試劑盒與德國拜法食品安全檢測和飼料監(jiān)控分析公司生產的萊克多巴胺ELISA檢測試劑盒的檢測符合率達95％以上。
　　 采用混合酸酐法制備的RCT-OVA偶聯(lián)抗原和膠體金標記萊克多巴胺單克隆抗體5C3，建立了檢測萊克多巴胺的膠體金免疫層析試驗方法，并組裝成標準化檢測卡。該檢測卡具有較好的敏感性和特異性，最低可檢測10ng/mL的萊克多巴胺，而與克倫特羅和沙丁胺醇無交叉反應。應用該方法對飼料、組織和尿液樣品中萊克多巴胺的最低檢測量分

7、別為0.05mg/kg,0.05mg/kg和10ng/mL.經廈門出入境檢驗檢疫局技術中心、四川出入境檢驗檢疫局、南通市畜產品質量檢驗測試中心和南京市棲霞區(qū)畜牧獸醫(yī)站等四家單位對人工添加樣品進行檢測，結果顯示當樣品中萊克多巴胺殘留濃度>10ng/mL時，本研究中研制的膠體金免疫檢測試紙條與德國拜法食品安全檢測和飼料監(jiān)控分析公司生產的萊克多巴胺ELISA檢測試劑盒檢測結果符合率均為100％;當樣品中萊克多巴胺殘留濃度>5ng/ml時，符合

8、率可達85％以上。
　　 應用萊克多巴胺單克隆抗體免疫檢測試劑檢測了不同來源的樣品。在江蘇檢驗檢疫局檢測豬肉樣品655份，萊克多巴胺ELISA試劑盒與LC-MSMS法對豬肉樣品檢測的符合率為100％。在吉林檢驗檢疫局檢測出口豬副產品31批次，萊克多巴胺未檢出。國家質量安全監(jiān)控計劃部分2008年8-10月份檢測進口凍豬副產品751批和鹽漬腸衣69批，萊克多巴胺不合格率6.95％;2009年8-10月檢測進口豬副產品869批，萊克多