動(dòng)力性肺動(dòng)脈高壓犬肺動(dòng)脈pcna及α┐平滑肌肌動(dòng)蛋白的表達(dá)

1、<p>　　動(dòng)力性肺動(dòng)脈高壓犬肺動(dòng)脈PCNA及α┐平滑肌肌動(dòng)蛋白的表達(dá)</p><p>　　作者：崔勤，楊景學(xué)，趙建斌，朱海龍 </p><p>　　【關(guān)鍵詞】 高血壓 </p><p>　　關(guān)鍵詞 :高血壓，肺性;疾病模型，動(dòng)物;血液動(dòng)力學(xué);增殖細(xì)胞核抗原;肌動(dòng)蛋白類 </p><p>　　摘 要:目的 探討平滑肌細(xì)胞

2、增殖在動(dòng)力性肺動(dòng)脈高壓形成中的作用. 方法 利用降主動(dòng)脈―左下肺動(dòng)脈分流建立的幼犬動(dòng)力性肺動(dòng)脈高壓模型，取90d肺組織病理切片，應(yīng)用鼠抗人增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）抗體、α-平滑肌細(xì)胞肌動(dòng)蛋白抗體（α-actin）、及Dako二抗免疫組化檢測(cè)，圖像分析儀對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行分析，然后計(jì)數(shù)高倍鏡下平滑肌細(xì)胞總數(shù)及PC-NA細(xì)胞陽(yáng)性數(shù)，計(jì)算細(xì)胞增殖指數(shù). 結(jié)果 分流犬左下肺動(dòng)脈中膜α-actin免疫組化染色呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，右下肺動(dòng)脈弱陽(yáng)性，而對(duì)

3、照組均呈陰性;分流犬左下肺動(dòng)脈PCNA陽(yáng)性信號(hào)表達(dá)明顯多于右肺動(dòng)脈，而右肺動(dòng)脈及左上肺動(dòng)脈僅有少量表達(dá);增殖指數(shù)左下肺動(dòng)脈內(nèi)膜為33%，中膜11%，外膜7%，右下肺動(dòng)脈僅為少量. 結(jié)論 平滑肌細(xì)胞增殖參與實(shí)驗(yàn)犬動(dòng)力性肺動(dòng)脈高壓形成過(guò)程并與肺動(dòng)脈壓力增高程度和肺血管重構(gòu)改變一致. </p><p>　　Keywords:hypertension，pulmonary;disease models，animal;h

4、emodynamics;proliferating cell nuclear antigen;actins </p><p>　　Abstract:AIM To explore the action of pulmonary artery smooth muscle cell proliferation in formation of dynamic pul-monary hypertension.METHO

5、DS Using the pulmonary hy-pertension（PH）model of shunt from descending aorta-to-left lower pulmonary artery，the sample of the lung tissue in shunt dogs was obtained on the90th day postoperation.The examination of PCNA an

6、dα-actin was done by immunohis-tochemistry method using PCAN andα-actin antibodies.The slices of pulmonary tissue were observed under high</p><p><b>　　0 引言 </b></p><p>　　肺動(dòng)脈高壓往往伴隨肺動(dòng)

7、脈結(jié)構(gòu)改變，而肺動(dòng)脈的病理改變又是肺動(dòng)脈壓力持續(xù)上升的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)，其最基本的病理改變既是平滑肌細(xì)胞的增殖肥大.增殖細(xì)胞核抗原（PCNA），平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-actin）是反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的重要生物學(xué)指標(biāo).我們利用免疫組化技術(shù)觀察平滑肌細(xì)胞增殖在肺動(dòng)脈高壓發(fā)病過(guò)程中的作用. </p><p><b>　　1 材料和方法 </b></p><p>　　1.1 材料

8、 </p><p>　　雜種幼犬，年齡2～3mo，體質(zhì)量3.5～4.5kg，雌雄不拘，分兩組:組1為分流組（n=12），全部行左側(cè)開(kāi)胸，降主動(dòng)脈向左下肺動(dòng)脈分流術(shù)，術(shù)后90d放血處死，取肺組織行病理學(xué)檢測(cè).鼠抗人PCNA（1∶100）抗體，鼠抗人α-actin（1∶100）抗體和生物素化羊抗鼠（1∶200）抗體，均為博士德公司產(chǎn)品，微波修復(fù)液DAB顯色液，0.01mmol&#12539;L-1 PBS

9、液為本院病理科配制.圖像分析儀（Leica Q570c）為德國(guó)產(chǎn)品. </p><p>　　1.2 方法 </p><p>　　利用降主動(dòng)脈―左下肺動(dòng)脈分流建立的幼犬動(dòng)力性肺動(dòng)脈高壓模型［1］ ，取90d肺組織病理切片，用免疫S-P兩步法進(jìn)行.石蠟切片脫蠟至水后0.01mol L-1 pH7.4PBS液洗滌5min×3次（下同），30mL&#12539;L-1 H

10、2 O 2 封閉30min，置于微波處理液中微波處理10min，冷卻，洗滌，加一抗4℃過(guò)夜，37℃水箱溫浴60min，生物素化二抗（羊抗鼠）37℃，30min，DAB5mg+H2 O 2 5mL顯色5～10min后水洗，蘇木素襯染30s，鹽酸酒精分化，氨水返藍(lán)，水洗，脫水、透明、常規(guī)封片鏡檢.每張切片隨機(jī)選取5個(gè)不同部位，計(jì)數(shù)每個(gè)高倍鏡下平滑肌細(xì)胞總數(shù)及PCNA細(xì)胞陽(yáng)性數(shù)計(jì)算細(xì)胞增殖指數(shù).空白對(duì)照實(shí)驗(yàn):PBS替代第一抗體，替代對(duì)照實(shí)驗(yàn):

11、小牛血清替代第一抗體.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:數(shù)據(jù)以百分?jǐn)?shù)（%）表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用方差分析（χ2 ）處理. </p><p><b>　　2 結(jié)果 </b></p><p>　　2.1 PCNA免疫組化結(jié)果 </p><p>　　手術(shù)后90d可見(jiàn)分流犬左下肺動(dòng)脈內(nèi)膜細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)較多棕黃色染色，中膜較少，右肺動(dòng)脈及左上肺動(dòng)脈僅有少量表達(dá)，空白對(duì)照組

12、和替代對(duì)照組呈陰性表達(dá)（P&lt;0.01，Tab1）.表1 分流犬不同部位肺動(dòng)脈細(xì)胞增殖指數(shù)（略） </p><p>　　2.2 α-actin免疫組化結(jié)果 </p><p>　　α-actin免疫組化染色顯示分流犬左下肺動(dòng)脈中膜α-actin呈陽(yáng)性表達(dá)，對(duì)照組陰性表達(dá).手術(shù)后90d可見(jiàn)分流犬左下肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)較多棕黃色染色（P&lt;0.01），右肺

13、動(dòng)脈及左上肺動(dòng)脈僅有少量，空白對(duì)照組替代對(duì)照組呈陰性表達(dá). </p><p>　　2.3 Ⅰ，Ⅲ型膠原纖維免疫組化結(jié)果 </p><p>　　分流后90d，分流犬肺動(dòng)脈壁內(nèi)Ⅰ、Ⅲ兩型膠原均有增多，左下肺動(dòng)脈多于右下肺動(dòng)脈，肺間質(zhì)內(nèi)也可見(jiàn)到膠原纖維的 </p><p><b>　　出現(xiàn). </b></p><p

14、><b>　　3 討論 </b></p><p>　　正常情況下肺動(dòng)脈中各種纖維含量較少，平滑肌細(xì)胞處于“休眠期”［2］ ，α-actin表達(dá)陰性或弱陽(yáng)性.當(dāng)其受到一定刺激時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞及激活的血小板細(xì)胞釋放有關(guān)因子如內(nèi)皮依賴生長(zhǎng)因子（EDGF）、血小板依賴生長(zhǎng)因子（PDGF）及內(nèi)皮素（ET）等，促進(jìn)血管平滑肌迅速增殖，而且具有成纖維細(xì)胞樣功能產(chǎn)生膠原纖維和彈力纖維，用以適應(yīng)改變的血管

15、張力［3］ .平滑肌肌動(dòng)蛋白α-actin，作為平滑肌細(xì)胞的標(biāo)記物，對(duì)于了解肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增生情況有重大意義.PC-NA是一種核蛋白質(zhì)、DNA聚合酶輔助因子［4］ .PC-NA的含量在細(xì)胞周期的G1 期開(kāi)始增加，S期達(dá)高峰，G2 ，M期降低，G0 期測(cè)不到，其量的變化與DNA合成一致，靜止細(xì)胞PCNA表達(dá)極低，增殖活躍細(xì)胞PCNA表達(dá)明顯增加［5］ .Speir等［6］ 認(rèn)為，引起細(xì)胞增殖的多種信號(hào)途徑匯聚在G1 /S期交界處并具有一

16、個(gè)引起DNA復(fù)制的共同機(jī)制，PCNA表達(dá)為細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期進(jìn)行DNA復(fù)制和分裂增殖所必需，應(yīng)用反義PCNA寡核苷酸能有效抑制平滑肌細(xì)胞PC-NA表達(dá)和平滑肌細(xì)胞增殖.因此，PCNA是反映細(xì)胞增殖的另一重要生物學(xué)指標(biāo).Liu等［7</p><p>　　我們實(shí)驗(yàn)中的分流犬左下肺動(dòng)脈管壁內(nèi)膜和中膜明顯增厚，PCNA陽(yáng)性率增加，平滑肌細(xì)胞主要為合成表型，部分細(xì)胞呈退化跡象;膠原纖維豐富，分布較廣，在血管中、內(nèi)、外膜均可見(jiàn)

17、到，其排列不整，α-actin在中、內(nèi)膜均表達(dá)陽(yáng)性，以中膜為主;PCNA表達(dá)主要在內(nèi)膜為多，這與低氧所造成的肺動(dòng)脈改變有著明顯的不同［10-13］ ，低氧所致的PCNA表達(dá)多位于外膜，而產(chǎn)生這一差異的機(jī)制尚不清楚，可能與肺動(dòng)脈高壓形成原因不同有關(guān).低氧性肺動(dòng)脈高壓其成因在于低氧引起的肺血管痙攣，長(zhǎng)期刺激造成多種細(xì)胞因子發(fā)生變化;動(dòng)力性肺動(dòng)脈高壓的產(chǎn)生的緣于來(lái)自體動(dòng)脈的高壓血流，造成肺血管及其血管內(nèi)的血液成分受到的切應(yīng)力發(fā)生改變，一方面，

18、高壓血流直接作用于一直處于低壓狀態(tài)的肺血管，并在其中產(chǎn)生湍流，導(dǎo)致肺血管內(nèi)皮損傷;另一方面，在高切應(yīng)力作用下，引起血小板的快速釋放反應(yīng)，血小板聚集，釋放促血管收縮物質(zhì).兩種原因同時(shí)起步，導(dǎo)致肺血管管壁增厚，管腔狹小或閉塞.管壁僵硬，血管阻力增加，導(dǎo)致肺動(dòng)脈壓力進(jìn)一步升高. </p><p>　　肺動(dòng)脈高壓導(dǎo)致血管平滑肌SMC的大量增殖.是肺動(dòng)脈高壓患兒出現(xiàn)肺血管改變的主要原因之一.從實(shí)驗(yàn)犬不同部位肺血管PCNA

19、表達(dá)中我們可以看出，血管內(nèi)不同壓力改變，對(duì)PCNA的表達(dá)產(chǎn)生重大影響.此結(jié)果與Jones等［14］ 應(yīng)用免疫組化方法對(duì)持續(xù)性肺動(dòng)脈高壓患者肺組織活檢結(jié)果相一致，即不同肺動(dòng)脈壓力改變，產(chǎn)生不同肺血管改建，分流犬左下肺動(dòng)脈主要接受分流來(lái)的高壓體動(dòng)脈血，進(jìn)而迅速產(chǎn)生肺動(dòng)脈高壓并出現(xiàn)病理性改變，PCNA表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性，而右下肺動(dòng)脈主要接受來(lái)自右心室的低壓血流，盡管血流有所增多，但肺循環(huán)血流動(dòng)力學(xué)改變不著，病理改變也不顯著，PCNA呈弱陽(yáng)性表達(dá).Ev

20、erett等［15］ 對(duì)年齡為42d的SD大鼠通過(guò)建立主動(dòng)脈與腔靜脈間分流造成肺動(dòng)脈血流增多，而肺動(dòng)脈壓力并無(wú)明顯升高動(dòng)物模型也出現(xiàn)相同結(jié)果. </p><p><b>　　參考文獻(xiàn): </b></p><p>　?。?］Cui Q，Zhu HL，Yang JX，Liu XZ，Zhao JB.The establishment of the experiment

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