畢業(yè)論文—甜茶中黃酮類物質(zhì)的研究

1、<p><b>　　畢 業(yè) 論 文</b></p><p>　　甜茶中黃酮類物質(zhì)的研究</p><p>　　學(xué)院（系） 輕工與食品工程學(xué)院 </p><p>　　專 業(yè) 食品科學(xué)與工程 </p><p>　　(食品質(zhì)量與安全方向)</p><p>　　班 級(jí)

2、 2005級(jí)（1）班 </p><p>　　學(xué) 號(hào) 0505100533 </p><p>　　姓 名 韓 斌 </p><p>　　指導(dǎo)教師 黃 麗 </p><p>　　二零零九年五月三十日</p><p><b&g

3、t;　　摘 要</b></p><p>　　本研究對(duì)廣西甜茶中的黃酮類物質(zhì)進(jìn)行研究，初步推斷出甜茶中黃酮類物質(zhì)的種類及其抗氧化性，并結(jié)合LC-MS技術(shù)驗(yàn)證了推論，為進(jìn)一步對(duì)甜茶中黃酮類物質(zhì)的研究打下了基礎(chǔ)。</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)以廣西甜茶為原料，通過(guò)大孔樹(shù)脂分離純化得到Y(jié)相，利用三種不同的萃取系統(tǒng)對(duì)Y相萃取，確定最適的萃取系統(tǒng)。取甜茶黃酮萃取液，通過(guò)DPPH自由基清除能

4、力與羥自由基清除能力測(cè)定其抗氧化能力，同時(shí)結(jié)合LC-MS技術(shù)測(cè)定甜茶中黃酮類化合物的種類及其分子結(jié)構(gòu)。</p><p>　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：采用乙酸乙酯-水-乙酸系統(tǒng)萃取Y相的效果最好，其</p><p>　　黃酮含量達(dá)到62.5％。抗氧化實(shí)驗(yàn)反映出抗氧化能力隨萃取液中黃酮含量的升高而增強(qiáng)，結(jié)合LC-MS技術(shù)確定其抗氧化確由甜茶中黃酮類化合物引起，且以黃酮甙類的形式存在，其中甙元可能包含鞣花

5、酸、槲皮素及山奈酚。</p><p>　　關(guān)鍵詞：甜茶 黃酮 抗氧化 </p><p>　　The research on the flavonoids in Sweet tea</p><p><b>　　Abstract</b></p><p>　　This paper experiments aimed at

6、researching the flavonoids in the Sweet tea in Guangxi. This research initially confirmed the anti-oxidative activity and the species of the flavonoids, associated with LC-MS techniques to prove the inference, and laying

7、 foundation for the late researches on the flavonoids in sweet tea.</p><p>　　The experiment use Guangxi sweet tea as the raw material and get the Y-phase through seperation and purification by macroadsorptio

8、n resin, then using three different extraction systems to extract the Y-phase. Through the application of the three systems, it will ascertain the most suited system. The extracted flavonoids will be tested the antioxida

9、nt capacity by DPPH free radical clearance ability and hydroxyl radical clearance ability, by extracting the flavonoids-extraction from the sweet tea,</p><p>　　The result shows that the ethyl acetate-hydroly

10、sis-acetic acid system is the best way to extract the Y-phase, and the content of flavonoids is 62.5% Anti-oxidative experiments reflects that the anti-oxidative ability improves with the contents of flavonoids in extrac

11、tion liquid, associated with LC - MS techniques to determine that its antioxidant is caused by flavonoids in the sweet tea, which exists in the form of flavonoid glycosides and the aglucon can contain ellagic acid, querc

12、etin-3-L-rham</p><p>　　Keywords: Sweet tea flavonoids anti-oxidative</p><p><b>　　目 錄</b></p><p><b>　　摘 要i</b></p><p>　　Abstractii</p>

13、;<p><b>　　目 錄iii</b></p><p><b>　　第一章 緒論1</b></p><p>　　1.1 甜茶概述1</p><p>　　1.2 黃酮類化合物1</p><p><b>　　1.2.1概述1</b></p>

14、<p>　　1.2.2黃酮類化合物的理化性質(zhì)2</p><p>　　1.3黃酮類化合物的提取與分離純化工藝3</p><p>　　1.3.1黃酮類化合物的提取工藝3</p><p>　　1.3.2黃酮類化合物的分離純化工藝4</p><p>　　1.3.3甜茶中黃酮類化合物研究現(xiàn)狀5</p><p&

15、gt;　　1.4 抗氧化劑及抗氧化效果評(píng)價(jià)5</p><p>　　1.4.1抗氧化劑概念及分類5</p><p>　　1.4.2抗氧化作用機(jī)理6</p><p>　　1.4.3抗氧化效果評(píng)價(jià)6</p><p>　　1.4.3甜茶黃酮類化合物抗氧化作用研究現(xiàn)狀6</p><p>　　1.5 LC-MS概述7&

16、lt;/p><p>　　1.4.1電噴霧8</p><p>　　1.4.2大氣壓化學(xué)電離8</p><p>　　1.4.3 LC-MS應(yīng)用9</p><p>　　1.6 本課題研究?jī)?nèi)容9</p><p>　　第二章 甜茶內(nèi)黃酮的提取與抗氧化研究11</p><p>　　2.1實(shí)驗(yàn)材料和設(shè)備

17、11</p><p>　　2.1.1實(shí)驗(yàn)原料11</p><p>　　2.1.2試劑和藥品11</p><p>　　2.1.3主要儀器和設(shè)備11</p><p>　　2.2.實(shí)驗(yàn)方法12</p><p>　　2.2.1 Y相的制備12</p><p>　　2.2.2萃取Y相中黃酮類物

18、質(zhì)12</p><p>　　2.2.2.1 正丁醇-水系統(tǒng)萃取Y相12</p><p>　　2.2.2.2 乙酸乙酯-水系統(tǒng)萃取Y相12</p><p>　　2.2.2.3 乙酸乙酯-水-乙酸系統(tǒng)萃取Y相13</p><p>　　2.2.3萃取相中黃酮含量的測(cè)定13</p><p>　　2.2.4萃取相中黃酮

19、抗氧化活性研究14</p><p>　　2.2.4.1 DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)14</p><p>　　2.2.4.2 羥自由基清除實(shí)驗(yàn)14</p><p>　　2.3 結(jié)果與討論15</p><p>　　2.3.1不同萃取系統(tǒng)對(duì)Y相中黃酮萃取效果的影響15</p><p>　　2.3.2 甜茶黃酮抗氧化活性

20、評(píng)價(jià)17</p><p>　　2.4本章小結(jié)19</p><p>　　第三章 甜茶中黃酮類化合物的初步鑒定21</p><p>　　3.1實(shí)驗(yàn)材料和設(shè)備21</p><p>　　3.2實(shí)驗(yàn)方法21</p><p>　　3.3結(jié)果與討論22</p><p>　　3.4本章小結(jié)31&l

21、t;/p><p>　　第四章 總結(jié)與展望32</p><p><b>　　5.1 總結(jié)32</b></p><p><b>　　5.2展望32</b></p><p><b>　　參考文獻(xiàn)33</b></p><p><b>　　致 謝

22、36</b></p><p><b>　　第一章 緒論</b></p><p><b>　　1.1 甜茶概述</b></p><p>　　甜茶，學(xué)名Rubus Suavissmus S，Lee，英文名Sweet tea leaves，是薔薇科懸鉤子屬植物的一個(gè)新品種，是我國(guó)八十年代初藥物調(diào)查時(shí)才開(kāi)始發(fā)現(xiàn)，主要生

23、長(zhǎng)在南亞熱帶，在我國(guó)主要分布于廣西、云南、四川和湖南等地。甜茶葉在廣西民間應(yīng)用已久，常用來(lái)代糖加工食品，民間入藥用于補(bǔ)腎降壓，被譽(yù)為神茶。甜茶的甜度很高，每公斤干茶葉的甜度相當(dāng)于15公斤蔗糖的甜度，每公斤甜茶素相當(dāng)于300公斤的蔗糖甜度。同時(shí)甜茶素是一種二萜葡萄糖低熱量甜料。</p><p>　　甜茶中富含豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，據(jù)廣西技術(shù)監(jiān)督局分析測(cè)試研究中心等單位測(cè)試結(jié)果證實(shí)：廣西甜茶中富含18種氨基酸，每100克干

24、品含氨基酸總量331.54毫克，特別是甜茶中富含人體必須的、人體不能生成，只能從食物中吸收的8種氨基酸。甜茶含豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和人體所必需的微量元素，主要有鈣0.84%、鋅105.5mg/kg、鍺5.5μg/kg、硒17.94μg/kg，及鉀、鎂、磷、鐵、鈉、銅、鉻、鍶、鋰等多種元素，不含砷鋁等有毒物質(zhì)，不含會(huì)產(chǎn)生頭暈、心跳加速、心悸、焦慮易怒、心理不適、干擾睡眠、肌肉震顫等副作用的咖啡因；其中所含的鍺、硒等，均優(yōu)于一般綠茶和苦丁茶，除上

25、述所含微量元素外，還富含維生素C、B1、B2、B3、超氧化物岐化酶，鮮甜茶中維生素C的含量高達(dá)115mg/100g。</p><p>　　甜茶具有多種保健作用，日本研究發(fā)現(xiàn)，甜茶對(duì)花粉過(guò)敏及其它鼻炎、皮膚炎等防治有明顯療效；高血壓、糖尿病和肥胖癥患者長(zhǎng)期飲用，有良好保健作用，同時(shí)還是高溫作業(yè)者理想飲料；此外，甜茶還具有清熱、潤(rùn)肺、祛痰、止咳之功效。近年來(lái)甜茶己風(fēng)靡日本、歐州、美國(guó)及中東等國(guó)家市場(chǎng)，我國(guó)沿海發(fā)達(dá)地區(qū)

26、也開(kāi)始使用，據(jù)預(yù)測(cè)，隨著人們生活水平的提高和保健意識(shí)的增強(qiáng)，以及工業(yè)發(fā)展、環(huán)境污染嚴(yán)重，甜茶必將會(huì)成為保健治療又一常規(guī)主導(dǎo)消費(fèi)品，市場(chǎng)消費(fèi)量大，前景看好[1-3]。</p><p>　　1.2 黃酮類化合物</p><p><b>　　1.2.1概述</b></p><p>　　黃酮類化合物(flavonoids)是泛指兩個(gè)芳環(huán)（A與B）通過(guò)三

27、碳鏈相互聯(lián)結(jié)而成的一系列化合物，基本結(jié)構(gòu)為C6—C3—C6。廣泛存在于植物界中，多具有顏色，且多為淺黃色或黃色結(jié)晶。具有多方面的生理活性，例如降血脂、擴(kuò)張冠脈、止血、鎮(zhèn)咳、祛痰、降低血管脆性等。</p><p>　　由黃酮類化合物(flavonoids)與糖結(jié)合的甙叫做黃酮甙(flavonoid glycosides)。它們的甙元是黃酮類化合物，是一類存在于天然界的、具有2-苯基色原酮(flavone)結(jié)構(gòu)的化合

28、物。它們分子中有一個(gè)酮式羰基，第一位上的氧原子具堿性，能與強(qiáng)酸形成鹽，其羥基衍生物多具黃色，故又稱黃堿素或黃酮[6-7]。</p><p>　　1.2.2黃酮類化合物的理化性質(zhì)[8-9]</p><p>　　1.2.2.1物理性狀</p><p>　　黃酮類化合物多為結(jié)晶性固體，少數(shù)（如黃酮甙類）為無(wú)定形粉末。游離的各種甙元母核中，除二氫黃酮、二氫黃酮醇、黃烷及黃烷

29、醇有旋光性外，其余則無(wú)化學(xué)活性。甙類由于在結(jié)構(gòu)中引入糖的分子，故均有旋光性，且多為左旋。黃酮類化合物是否有顏色與分子中是否存在交叉共軛體系及助色團(tuán)（-OH、-OCH3等）的種類、數(shù)目以及取代位置有關(guān)。一般情況下，黃酮、黃酮醇及其甙類多顯灰黃～黃色，查耳酮為黃～橙黃色，而二氫黃酮、二氫黃酮醇、異黃酮類，因不具有交叉共軛體系或共軛鏈短，故不顯色（二氫黃酮及二氫黃酮醇）或顯微黃色（異黃酮）。</p><p>　　1.2

30、.2.2溶解性</p><p>　　黃酮甙元難溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、醋酸乙酯、乙醚等有機(jī)溶劑及稀堿液中。其中黃酮、黃酮醇、查耳酮等平面性強(qiáng)的分子，因分子與分子間排列緊密，分子間引力較大，故難溶于水；而二氫黃酮及二氫黃酮醇等非平面分子，分子間排列不緊密，分子間引力較低，有利于水分子進(jìn)入，易溶于水?；ㄉ霸ɑㄇ嗨兀╊愐噪x子形式存在，水中溶解度較大。黃酮類甙元分子中羥基數(shù)越多，水中的溶解度越大。黃酮甙類，因

31、為引入糖，水溶性比相應(yīng)甙元為大；糖鏈越長(zhǎng)，則水溶度越大，一般易溶于水、甲醇、乙醇等強(qiáng)極性溶劑中，但難溶或不溶于苯、氯仿等有機(jī)溶劑中。</p><p>　　1.2.2.3酸堿性</p><p>　　黃酮類化合物因分子中多含有游離酚羥基，故顯酸性，可溶于堿性溶液中。酸性強(qiáng)弱順序依次為：7，4’-二OH 7-或4’-OH 一般酚OH 5-OH >3-OH。此性質(zhì)可用于提取、分離及鑒定工作

32、。</p><p>　　黃酮類化合物分子中-吡喃酮環(huán)上的1-位氧原子，因有未共用的電子對(duì)，故表現(xiàn)微弱的堿性，可與強(qiáng)無(wú)機(jī)酸，如濃硫酸、鹽酸等生成鹽，但生成的鹽不穩(wěn)定，加水可分解。</p><p>　　1.3黃酮類化合物的提取與分離純化工藝</p><p>　　1.3.1黃酮類化合物的提取工藝[10-17]</p><p>　　黃酮類化合物因其結(jié)

33、構(gòu)和來(lái)源的不同，溶解特性差異也很大，因此應(yīng)據(jù)其極性和水溶性的大小選擇合適的溶劑進(jìn)行提取。目前，對(duì)甙類和極性較大的甙元，常用某些極性較大的混合劑(甲醇：水=1：1)、水、甲醇、乙醇、丙醇、乙酸乙酯進(jìn)行提取，而對(duì)大多數(shù)甙元?jiǎng)t采用乙醚、氯仿、乙酸乙酯等極性較小的溶劑進(jìn)行提取，并且一些研究者為了提高所得產(chǎn)物的收率，還采用了外加物理場(chǎng)的方法，現(xiàn)簡(jiǎn)單介紹如下：</p><p>　?。?）有機(jī)溶劑提取法</p>

34、<p>　　這是目前國(guó)內(nèi)外使用較廣泛的提取方法，該法設(shè)備簡(jiǎn)單，產(chǎn)品得率高，很容易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)但產(chǎn)品中雜質(zhì)含量較高。常用的有機(jī)溶劑有甲醇、乙醇、丙酮等，高體積濃度的醇(如90％ ～95％ )適于提取甙元，體積濃度60％左右的醇適于提取甙類。提取次數(shù)一般是2～4次，可用冷浸法或加熱抽提法提取。</p><p><b>　?。?）熱水提取法</b></p><p&g

35、t;　　熱水提取可用浸提法也可用煮提法，一般提取2～3次，由于黃酮甙類物質(zhì)易溶于水，故而本法僅限于提取甙類，雖然設(shè)備簡(jiǎn)單，但因提取雜質(zhì)多，收率較低，本法常用來(lái)提取黃酮甙類含量較高的原料。</p><p>　?。?）堿性水或堿性稀醇提取法</p><p>　　黃酮甙類有一定極性，溶于水，易溶于堿性水，難溶于酸性水，故可用堿性水進(jìn)行提取，再將堿性提取液調(diào)成酸性，黃酮甙類即沉淀析出。堿性提取時(shí)，

36、所用堿的濃度不宜過(guò)高，以免在強(qiáng)堿條件下加熱破壞黃酮類化合物的母核，加酸酸化時(shí)，酸性也不宜過(guò)強(qiáng)，以免生成佯鹽，致使析出的黃酮化合物又重新溶解，降低產(chǎn)品收率。一般可以根據(jù)原料不同而使用不同的堿性溶液。 </p><p><b>　?。?）超濾法</b></p><p>　　黃酮類化合物的分子量多在lkD以下，而多糖、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的分子量多在50kD以上，利用超濾法含有兩種

37、或兩種以上溶質(zhì)的溶液，通過(guò)濾膜分離流動(dòng)時(shí)，其中分子體積小的溶質(zhì)，經(jīng)濾膜流出，而分子體積較大的溶質(zhì)，不能通過(guò)濾膜而被截留的原理，使用超濾法能除多糖、蛋白質(zhì)等去這些雜質(zhì)，提高黃酮等有效成分含量，而且在分析過(guò)程中無(wú)相變，有效成分理化性能穩(wěn)定，結(jié)果重復(fù)性好，準(zhǔn)確性高，并且在提取生產(chǎn)過(guò)程中，可以減少?gòu)U水排放，避免臭水、污水的產(chǎn)生，能降低生產(chǎn)成本。</p><p><b>　　（5）超聲波提取法</b>

38、</p><p>　　超聲波具有特殊的生物效應(yīng)，選擇適當(dāng)?shù)某晠?shù)可以使植物細(xì)胞壁問(wèn)形成較多的小孔，從而可以增強(qiáng)細(xì)胞膜的透性和選擇性，使溶劑易于滲入細(xì)胞內(nèi)同時(shí)超聲波所產(chǎn)生的強(qiáng)烈振動(dòng)能給植物和溶劑帶來(lái)了巨大的能量，使它們能夠更快速的運(yùn)動(dòng)，加快了有效成分的浸出，大大提高了提取效率。郭孝武曾研究過(guò)超聲波和熱堿提取對(duì)蘆丁成分影響的比較，發(fā)現(xiàn)超聲波輔助萃取不會(huì)破壞蘆丁成分結(jié)構(gòu)，能夠縮短提取時(shí)間，提高有效成分的提出率和藥材的

39、利用率。杭州商學(xué)院的畢麗君也曾用超聲波法提高了香椿嫩葉中黃酮類化合物的提取率。</p><p><b>　　（6）微波提取法</b></p><p>　　微波雖然不能破壞生物體內(nèi)的共價(jià)鍵，但對(duì)氫鍵、范德化力、疏水相互作用等生物大分子高級(jí)結(jié)構(gòu)的次級(jí)鍵具有一定的破環(huán)作用，他可以改變細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞膜電位的變化，這些變化對(duì)于細(xì)胞中有效組分的浸出都是很有作用的。大連化學(xué)物理研

40、究所的李嶸等人曾用微波法提取過(guò)銀杏葉中的黃酮甙，他們發(fā)現(xiàn)，溶劑萃取前對(duì)原料和水的混合液進(jìn)行短時(shí)間微波處理，能大大提高黃酮提取率和縮短溶劑萃取所需的時(shí)間。</p><p>　　1.3.2黃酮類化合物的分離純化工藝[18-21]</p><p>　　黃酮類化合物的分離純化方法很多，有柱層析、薄層層析、鉛鹽沉淀、硼酸絡(luò)合、pH梯度萃取、溶劑萃取以及近年來(lái)應(yīng)用的高效液相色譜(HPLC)、液滴逆流層

41、析(DCCC)、氣相層析、微乳薄層色譜等，但均存在不同程度的缺點(diǎn)而限制了其工業(yè)化生產(chǎn)。目前應(yīng)用較多的方法有如下幾種：</p><p><b>　　（1）硅膠柱層析法</b></p><p>　　此法應(yīng)用范圍最廣，主要適于分離異黃酮、二氫黃酮、二氫黃酮醇及高度甲基化（或乙?；┑狞S酮及黃酮醇類。少數(shù)情況下，在加水去活化后也可用于分離極性較大的化合物，如多羥基黃酮醇及其甙

42、類等。使用本方法的關(guān)鍵是選擇合適的洗脫劑，一般常用的洗脫劑的洗脫能力如下：石油醚＜四氯化碳＜苯＜氯仿＜乙醚＜乙酸乙酯＜吡啶＜丙酮＜正丙醇＜乙醇＜甲醇＜水。</p><p>　　（2）大孔樹(shù)脂吸附法</p><p>　　大孔樹(shù)脂是近l0年來(lái)發(fā)展起來(lái)的是一種具有多孔立體結(jié)構(gòu)人工合成的聚合物吸附劑，其利用吸附質(zhì)與吸附劑即吸附樹(shù)脂之間的作用力，即范德華力對(duì)物質(zhì)進(jìn)行有選擇性地吸附。它具有物化穩(wěn)定性高

43、、吸附選擇性好、不受無(wú)機(jī)物存在的影響、再生簡(jiǎn)便、解吸條件溫和、使用周期長(zhǎng)、宜于構(gòu)成閉路循環(huán)、節(jié)省費(fèi)用等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于物質(zhì)的分離純化。</p><p>　?。?）聚酰胺柱層析法</p><p>　　聚酰胺是由酰胺聚合而成的一類大分子化合物。對(duì)分離黃酮類化合物來(lái)說(shuō)，聚酰胺是較為理想的吸附劑。其吸附強(qiáng)度主要取決于黃酮類化合物分子中羥基的數(shù)目與位置及溶劑與黃酮類化合物或與聚酰胺之間形成氫鍵締合能

44、力的大小。聚酰胺柱層析可用于分離各種類型的黃酮類化合物，包括甙及甙元、查耳酮與二氫黃酮等。</p><p>　　1.3.3甜茶中黃酮類化合物研究現(xiàn)狀</p><p>　　目前有關(guān)甜茶的黃酮類物質(zhì)的提取方法的研究，秦雪蓮提出用70％乙醇溶液提取甜茶中黃酮類化合物最佳工藝為：溫度80℃下，液—固比6：1，用70％乙醇溶液加熱提取3次，每次提取時(shí)間為50min。趙紅芳等“提出從云南甜茶中提取總黃

45、酮”最佳工藝為：在85℃下，固液比為1：25，70％乙醇回流提取4次，提取時(shí)間60min。近年出現(xiàn)一些強(qiáng)化物理法進(jìn)行黃酮類化合物萃取試驗(yàn)，主要是微波、超聲波技術(shù)和酶法結(jié)合提取方法，但至今還未發(fā)現(xiàn)這些技術(shù)在甜茶中應(yīng)用報(bào)道。</p><p>　　關(guān)于甜茶中黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)研究方面陳沖等“ 研究報(bào)道甜茶中含有黃酮及甙類等化合物”。陳全斌等人通過(guò)溶劑萃取、柱層析方法，得到甜茶總黃酮，通過(guò)酸、醇水解后分析廣西甜茶中的黃酮

46、甙元,利用HPLC、紅外光譜與NMR分析，表明甜茶中含有黃酮甙，其甙元分別為槲皮素及山奈酚。但是陳全斌等人的研究并沒(méi)有通過(guò)LC-MS等分子結(jié)構(gòu)鑒定技術(shù)鑒定甜茶中黃酮類化合物的分子結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步論證甜茶黃酮甙中包含槲皮素及山奈酚。從所報(bào)道的文獻(xiàn)來(lái)看，對(duì)黃酮類物質(zhì)研究甚少，僅僅只是報(bào)道有這類物質(zhì)存在，并無(wú)黃酮試單體化合物的相關(guān)報(bào)道，也沒(méi)有關(guān)于LC-MS、核磁共振等結(jié)構(gòu)鑒定技術(shù)應(yīng)用于甜茶黃酮類化合物的研究，即目前沒(méi)有關(guān)于甜茶中黃酮類化合物的分子

47、結(jié)構(gòu)的研究。</p><p>　　1.4抗氧化劑及抗氧化能力測(cè)定[22-27]</p><p>　　1.4.1抗氧化劑概念及分類</p><p>　　抗氧化劑是阻止氧氣不良影響的物質(zhì)，它能幫助捕獲并中和自由基，從而祛除自由基對(duì)人體損害的一類物質(zhì)。主要包括以下幾類：自由基吸收劑：如酚類抗氧化劑，維生素 E，類胡羅卜素。氧清除劑：如類胡羅卜素及其衍生物、抗壞血酸、抗壞血

48、酸棕櫚酸酯、異抗壞血酸和異抗壞血酸鈉等。金屬離子螯合劑：枸櫞酸、EDTA和磷酸衍生物。</p><p>　　1.4.2抗氧化作用機(jī)理</p><p>　　不同的結(jié)構(gòu)抗氧化劑抑制氧化的機(jī)理各不相同。其中大部分抑制劑的作用原理是與脂游離基發(fā)生反應(yīng)，形成不活潑的物質(zhì)，比如與脂過(guò)氧化物降解形成的過(guò)氧化物自由基或者烷氧化物自由基反應(yīng)。另有一些抑制劑作用原理是穩(wěn)定氫過(guò)氧化物以防止進(jìn)一步生成自由基。金屬

49、離子可以催化氫過(guò)氧化物的降解，一些能夠螯合金屬離子的物質(zhì)也能起到抑制氧化的作用。一些被稱作增效劑的物質(zhì)被證明本身沒(méi)有抗氧化效果，但是可以增加抗氧化劑的抗氧化效果。還有一些氧化抑制劑通過(guò)形成非活潑基團(tuán)的方式降解脂過(guò)氧化物，從而起到降低游離基的效果。另外，單線態(tài)氧比三線態(tài)氧促進(jìn)氧化的能力強(qiáng)很多倍，因此單線態(tài)氧淬滅劑對(duì)于抑制脂氧化也有很好的效果。</p><p>　　1.4.3氧化效果評(píng)價(jià)方法</p>&

50、lt;p>　　抗氧化不僅僅是一個(gè)概念，對(duì)生物體抗氧化的效果是可以量化測(cè)定的。前，國(guó)內(nèi)外測(cè)定抗氧化劑能力的方法主要包括體內(nèi)和體外評(píng)價(jià)兩大類。</p><p>　　抗氧化的體內(nèi)測(cè)定評(píng)價(jià)方法主要有低密度脂蛋白(LDL)氧化分析法、生物體系中脂質(zhì)過(guò)氧化檢測(cè)法，動(dòng)物試驗(yàn)和人體血清中抗氧化能力與某種疾病關(guān)系的流行病學(xué)調(diào)查等。DL法就從健康成人血液中分離出LDL，再利用過(guò)渡金屬離子(如Cu2+)催化LDL氧化修飾，加入抗

51、氧化劑可抑制其氧化修飾的原理來(lái)評(píng)價(jià)抗氧化活性。脂質(zhì)過(guò)氧化檢測(cè)法，主要是利用硫代巴比妥酸法，通過(guò)測(cè)定血清或肝等組織勻漿中的脂質(zhì)過(guò)氧化物丙二醛(MDA)的量來(lái)反映抗氧化劑抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的能力。</p><p>　　抗氧化的體外測(cè)定方法非常多，它是食品天然抗氧化劑篩選和研究的重要方法，常見(jiàn)的體外測(cè)定法主要有以下幾種：</p><p>　　1.4.3.1清除羥自由基（·OH）的方法<

52、;/p><p>　　Fention反應(yīng)產(chǎn)生·OH羥自由基使鄰二氮菲- Fe2+氧化為鄰二氮菲—Fe3+,使鄰二氮菲- Fe2+在536nm處的最大吸收峰消失。根據(jù)536nm處光密度變化判斷受試物清除·OH的能力。需要注意的是，測(cè)定時(shí)加樣方法對(duì)結(jié)果有重要影響。需先將鄰二氮菲 、PBS及水混勻，并且每管加入FeSO4后立即混勻，否則會(huì)使局部顏色過(guò)濃，影響重復(fù)性。</p><p>

53、;　　1.4.3.2清除DPPH自由基法</p><p>　　清除DPPH·(l,1-二苯基-2-苦肼基自由基)法是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外普遍使用的一種研究抗氧化劑的方法，具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏、易檢測(cè)和直接可行的優(yōu)點(diǎn)被廣泛用于抗氧化劑的研究。DP是一種早期合成的有機(jī)自由基，常用來(lái)評(píng)估抗氧化物的供氫能力，它在有機(jī)溶劑中非常穩(wěn)定，呈紫色，而且在517nm處有一個(gè)特征吸收峰，當(dāng)遇到自由基清除劑時(shí)，DPPH的孤對(duì)電子被配

54、對(duì)而使其退色，也就是在最大吸收波長(zhǎng)處的吸光值變小。因此，可通過(guò)測(cè)定吸光值的變化來(lái)評(píng)價(jià)樣品對(duì)DPPH自由基的清除效果?？寡趸芰υ綇?qiáng)，吸光度值下降越大，溶液的顏色越淡。</p><p>　　1.4.3.3還原能力</p><p>　　還原力的測(cè)定是檢驗(yàn)樣品是否是良好的電子供體的方法。還原能力是從提供電子能力的角度來(lái)檢測(cè)物質(zhì)的抗氧化性，抗氧化劑通過(guò)自身的還原作用給出電子。在反應(yīng)中，抗氧化劑提供

55、的電子，能夠中斷自動(dòng)氧化成氫過(guò)氧化物的鏈鎖反應(yīng)，這樣就可以表現(xiàn)出該物質(zhì)的還原能力。測(cè)定還原能力實(shí)驗(yàn)中常以Fe3+作為氧化劑，將Fe3+還原為Fe2+，顏色由黃色變?yōu)樗{(lán)綠色，在紫外光譜中700nm處有強(qiáng)吸收。吸光值越大，表明還原能力越強(qiáng)，抗氧化性越強(qiáng)。</p><p>　　1.4.3.4抗油脂過(guò)氧化力測(cè)定</p><p>　　脂類包括的范圍很廣，是構(gòu)成生物膜的主要成分，脂類中的不飽和脂肪酸可

56、以過(guò)氧化，脂類過(guò)氧化過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生L、LO、LOO-等自由基以及LOOH，這些產(chǎn)物會(huì)損傷生物細(xì)胞。因此，能夠抑制脂類過(guò)氧化具有重要的生物學(xué)意義。硫氰酸鐵鹽(FTC)比色法是基于在酸性條件下，脂質(zhì)氧化形成的過(guò)氧化物可將Fe2+氧化成Fe3+，然后Fe3+與硫氰酸根離子可形成在480-515nm內(nèi)有最大吸收的紅色絡(luò)合物。通常用500nm處吸光值的高低表示物質(zhì)抗脂質(zhì)過(guò)氧化的能力，吸光值越小，表明物質(zhì)的抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力越強(qiáng)。</p>

57、<p>　　1.4.4甜茶黃酮類化合物抗氧化作用研究現(xiàn)狀</p><p>　　目前關(guān)于甜茶中黃酮類化合物抗氧化的研究還很少，張巧云“廣西甜茶中甜茶素和其他化學(xué)成分的研究”中利用磷鉬絡(luò)合物法測(cè)定甜茶總黃酮提取物的抗氧化活性，其抗氧化能力隨反應(yīng)時(shí)間和濃度的增加而增強(qiáng)，在相同濃度條件下要比人工合成的抗氧化劑BHT強(qiáng)得多。利用DPPH、羥自由基清除等抗氧化評(píng)價(jià)方法評(píng)價(jià)甜茶中黃酮類化合物的研究還是空白。<

58、/p><p>　　1.5 LC-MS概述[28-33]</p><p>　　采用LC與MS聯(lián)機(jī)的操作方式，可充分發(fā)揮液相色譜的分離功能和質(zhì)譜儀的高靈敏度及高選擇性（如單離子檢測(cè)、中性丟失等），來(lái)獲取一些混合物中單一組分的結(jié)構(gòu)信息。選用混合編程掃描技術(shù)，進(jìn)行多級(jí)質(zhì)譜方式（MS/MS或MSn）可同時(shí)檢測(cè)（準(zhǔn)）分子離子和若干碎片離子，進(jìn)一步獲取相關(guān)化合物的結(jié)構(gòu)信息。高效液相色譜-質(zhì)譜（多級(jí)）聯(lián)用儀的

59、在線使用首先要解決的問(wèn)題是真空的匹配。質(zhì)譜工作需在高真空下完成，要與常壓下工作的高效液相色譜（即大量流動(dòng)相的涌入）-質(zhì)譜接口相匹配并維持足夠的真空，只能采取增大真空泵的抽速，分段、多級(jí)抽真空的方法，形成真空梯度來(lái)滿足接口和質(zhì)譜正常工作的要求。LC-MS主要包括以下兩種電離方式。</p><p>　　1.5.1電噴霧(Electrospray Ionisation簡(jiǎn)稱 ESI)</p><p&g

60、t;　　ESI其電離過(guò)程是“離子霧化”。當(dāng)樣品溶液流出毛細(xì)管的瞬間，在加熱溫度、霧化氣（N2）和強(qiáng)電場(chǎng)（3-5kV）的作用下溶劑迅速霧化并產(chǎn)生高電荷液滴。隨著液滴的揮發(fā)，電場(chǎng)增強(qiáng)，離子向表面移動(dòng)并從表面揮發(fā)，產(chǎn)生單電荷或多電荷離子。通常小分子得到[M+H]+或[M-H]- 單電荷離子。而生物大分子產(chǎn)生Z>1的多電荷離子。由于質(zhì)譜儀測(cè)量的是質(zhì)量電荷比（m/Z）。因此質(zhì)量范圍只有幾千質(zhì)量數(shù)的質(zhì)譜儀能夠檢測(cè)質(zhì)量數(shù)十幾萬(wàn)的生物大分子。 &

61、lt;/p><p>　　ESI 屬于最軟的電離技術(shù)。其特點(diǎn)是通常只產(chǎn)生高豐度的準(zhǔn)分子離子峰。因此可測(cè)定不穩(wěn)定的極性化合物，并可直接分析混合物；多電荷離子的形成可分析大分子量化合物，如蛋白質(zhì)和寡核甙酸。（對(duì)蛋白質(zhì)的離子化效率接近100%）；通過(guò)調(diào)節(jié)離子源參數(shù)可控制離子的斷裂，從而給出結(jié)構(gòu)信息有助于化合物的定性分析（也稱源內(nèi)CID）。 ESI可供選擇的離子化模式有ESI（+）或ESI（-）。</p><

62、;p>　　1.5.2大氣壓化學(xué)電離（簡(jiǎn)稱APCl）</p><p>　　用于 HPLC/MS的APCl技術(shù)與傳統(tǒng)的化學(xué)電離不同，它并不采用諸如甲烷一類的反應(yīng)氣體，而是借助電暈放電（corona discharge）啟動(dòng)一系列氣相反應(yīng)來(lái)完成離子化過(guò)程。與ESI接口區(qū)別在于增加了一根電暈放電針，其功能為發(fā)射自由電子首先轟擊空氣中O2、N2、H2O產(chǎn)生如O2+、N2+、NO+、H2+O等初級(jí)離子，再由這些初級(jí)離子

63、與溶液中樣品流出毛細(xì)管時(shí)被氮?dú)饬黛F化到加熱管中被揮發(fā)的樣品分子進(jìn)行質(zhì)子或電子交換而使其離子化形成[M+H]+或[M-H]- 離子，而后聚焦，進(jìn)入分析器。 </p><p>　　APCl也屬于軟電離技術(shù)。其特點(diǎn)是只產(chǎn)生單電荷的準(zhǔn)分子離子峰。適用于分析弱極性的小分子化合物；快速地分析流動(dòng)相含水量高或低的樣品，適合做梯度洗脫；具有通過(guò)調(diào)節(jié)接口內(nèi)錐孔上的電壓來(lái)控制分子離子在離子源內(nèi)的斷裂程度（源內(nèi)CID），來(lái)獲得結(jié)構(gòu)信息

64、。 APCl可供選擇的離子化模式有APCl（+）或APCl（-）。無(wú)論選ESI或APCl模式，都是一次進(jìn)樣就可同時(shí)檢測(cè)正、負(fù)離子。 </p><p>　　1.5.3 LC-MS應(yīng)用</p><p>　　將液相的分析方法用于HPLC/MS（多級(jí)）聯(lián)用時(shí)需要考慮以下幾方面：1/分析目標(biāo)化合物的離子化能力，2/流動(dòng)相的混溶性，3/流速與柱子的匹配性等。 </p><p>

65、　　對(duì)于可以接受質(zhì)子的堿性樣品（如含NH2、N、NH、CO、COOR ），采用正離子化模式；反之對(duì)于易丟失質(zhì)子的，有較多強(qiáng)負(fù)電性基團(tuán)（如樣品含-COOH、–SH、–NO2、-Cl、-Br和多個(gè)羥基時(shí)）可嘗試使用負(fù)離子化模式。有些酸堿性并不明確的化合物則要進(jìn)行預(yù)試方可確定。此時(shí)也可優(yōu)先考慮選用APCl（+）進(jìn)行測(cè)定，對(duì)于熱不穩(wěn)定的化合物則優(yōu)先考慮選用ESI。 </p><p>　　對(duì)樣品的一般要求是：力求干凈，不含

66、顯著量的雜質(zhì)；不含高濃度的難揮發(fā)性酸（如硫酸，磷酸等）及其鹽，因這些酸及其鹽的侵入會(huì)引起很強(qiáng)的噪聲，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)造成儀器噴口處放電；樣品粘度不能過(guò)大，以防堵塞柱子、噴口及毛細(xì)管入口。因此，樣品的制備或前處理在HPLC/MS（多級(jí)）分析中同樣是必要的。 </p><p>　　應(yīng)用范圍：熱不穩(wěn)定大分子化合物（如生物藥品，重組產(chǎn)物，醫(yī)藥學(xué)方面的藥物及體內(nèi)藥物分析、藥物降解、藥物動(dòng)力學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、中藥分析）；生物化學(xué)領(lǐng)域的

67、肽、蛋白質(zhì)、寡核甙酸、糖等；環(huán)境化學(xué)分析方面（如有機(jī)污染物，土壤與水質(zhì)分析）；農(nóng)藥獸藥殘留量分析（如檢測(cè)蔬菜，水果及肉類食品中的農(nóng)殘和藥殘）；法醫(yī)學(xué)方面的濫用藥物、爆炸物和興奮劑檢測(cè)；合成化學(xué)方面的有機(jī)金屬化合物、有機(jī)合成物及表面活性劑、天然產(chǎn)物、復(fù)雜混合物分析等等。總之，只有無(wú)法離子化的樣品質(zhì)譜才不能檢測(cè)。與GC/MS相比LC/MS靈敏度更高。 </p><p>　　1.6本課題的研究?jī)?nèi)容</p>

68、<p>　?。?）以大孔樹(shù)脂吸附分離純化Y相為原料，選取三種不同的萃取系統(tǒng)對(duì)Y相萃取，研究三種萃取系統(tǒng)對(duì)甜茶中黃酮萃取效果的影響，同時(shí)爭(zhēng)取得到黃酮含量大于70%的組分。</p><p>　?。?）以萃取得到的黃酮含量大于70%萃取液為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)其進(jìn)行DPPH自由基清除與羥自由基清除實(shí)驗(yàn)，研究甜茶中黃酮類化合物的抗氧化活性。</p><p>　　（3）以抗氧化試驗(yàn)中的黃酮含量大

69、于70%萃取液為實(shí)驗(yàn)材料，利用LC-ESI-MS技術(shù)確定甜茶中黃酮的種類以及分子結(jié)構(gòu)。</p><p>　　第二章 甜茶內(nèi)黃酮類的提取與抗氧化研究</p><p>　　本章采用萃取法對(duì)大孔樹(shù)脂分離純化所得Y相進(jìn)行萃取，以期得到黃酮含量較高的組分。選用三種不同的萃取系統(tǒng)進(jìn)行萃取，對(duì)比三種萃取系統(tǒng)的萃取效果，最終確定Y相最適萃取方法。同時(shí)選取黃酮含量在百分之五十以上的萃取相，通過(guò)DPPH自由基

70、清除與羥自由基清除實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)甜茶中黃酮類物質(zhì)的抗氧化活性。</p><p>　　2.1實(shí)驗(yàn)材料和設(shè)備</p><p><b>　　2.1.1實(shí)驗(yàn)原料</b></p><p>　　廣西甜茶 </p><p>　　2.1.2試劑和藥品</p><p>

71、;　　蘆丁 分析純 北京化學(xué)試劑公司</p><p>　　乙酸 分析純 廣東光華化學(xué)廠有限公司</p><p>　　DPPH 分析純 Flnka公司</p><p>　　兒茶素 分析純

72、 Flnka公司</p><p>　　硝酸鋁 分析純 北京化工廠</p><p>　　正丁醇 分析純 廣東光華化學(xué)廠有限公司</p><p>　　氫氧化鈉 分析純 廣東光華化學(xué)廠有限公司<

73、;/p><p>　　亞硝酸鈉 分析純 廣東省臺(tái)山市化工廠</p><p>　　乙酸乙酯 分析純 上海申博化工有限公司</p><p>　　無(wú)水甲醇 分析純 廣東光華化學(xué)廠有限公司</p><p>　　無(wú)水

74、乙醇 分析純 廣東光華化學(xué)廠有限公司</p><p>　　30%雙氧水 分析純 廣州新建精細(xì)化工廠</p><p>　　鄰二氮菲 分析純 廣州化學(xué)試劑廠</p><p>　　硫酸亞鐵 分析純

75、 天津市大茂化學(xué)試劑廠</p><p>　　2.1.3主要儀器和設(shè)備</p><p>　　722分光光度計(jì) 天津市普瑞斯儀器有限公司</p><p>　　AL-204電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司</p><p>　　RE-52

76、AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠</p><p>　　9146A-DHG型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司</p><p>　　HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司</p><p>　　LG-10-2.4A高速離心機(jī)

77、 北京醫(yī)用離心機(jī)廠</p><p><b>　　2.2實(shí)驗(yàn)方法</b></p><p>　　2.2.1Y相的制備</p><p><b>　　Y相制備工藝如下：</b></p><p>　　甜茶葉→加水煮沸(兩次) →過(guò)濾→合并濾液→LSA10大孔樹(shù)脂柱吸附→水洗至無(wú)色→收集75％乙醇洗脫部分→旋轉(zhuǎn)

78、蒸發(fā)濃縮100倍體積→無(wú)水乙醇沉淀→得到無(wú)水乙醇濾液相Y。</p><p>　　提取與純化工藝，用熱水提取，溫度為80℃左右，料液比為1：15，提取兩次后合并濾液。濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后使用非極性或中極性的大孔樹(shù)脂粗純化。大孔樹(shù)脂純化時(shí)首先用蒸餾水洗脫至幾乎無(wú)色，這時(shí)能夠洗脫下粗提液中大多數(shù)的蛋白質(zhì)、無(wú)機(jī)鹽以及多糖類物質(zhì)。75%的乙醇溶液洗脫出樹(shù)脂中剩下的物質(zhì)，收集75%的乙醇洗脫相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮100倍體積，通過(guò)無(wú)水乙

79、醇對(duì)其進(jìn)行沉淀，得到無(wú)水乙醇沉淀相N以及無(wú)水乙醇濾液相Y。</p><p>　　2.2.2 萃取Y相中黃酮類化合物</p><p>　　2.2.2.1正丁醇-水系統(tǒng)萃取Y相</p><p>　　取10mlY相，正丁醇與水按照（v/v1：1）的比例，按照如下實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行萃取：</p><p>　　所得的萃余相A水相、B水相 ，萃取相A正丁醇相、

80、B正丁醇相四個(gè)相分別加一定量水在50℃條件下，進(jìn)行真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，直至沒(méi)有刺鼻的正丁醇味為止。</p><p>　　2.2.2.2乙酸乙酯-水系統(tǒng)萃取Y相</p><p>　　取10mlY相，用160ml無(wú)水乙醇溶解對(duì)Y相進(jìn)行沉淀,取乙醇溶解相于50℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，最終得到沉淀后的Y相25ml。取10ml沉淀后的Y相，按照2.3.2.1方法，用乙酸乙酯-水系統(tǒng)按照1：1的比例進(jìn)行萃取，最后得到

81、萃余相水相與萃取相乙酸乙酯相，按照如下方法進(jìn)行連續(xù)萃取：</p><p>　　合并所有水相為萃余相A水相、合并所有乙酸乙酯相為萃取相A乙酸乙酯相，在50℃條件下，進(jìn)行真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，直至四個(gè)相沒(méi)有刺鼻的乙酸乙酯味為止。并記錄萃余相A水相、萃取相A乙酸乙酯相體積。</p><p>　　2.2.2.3乙酸乙酯-水-乙酸系統(tǒng)萃取Y相</p><p>　　取10ml2.2.2

82、.2中沉淀后的Y相，在Y相中加入0.01％的乙酸，按照2.2.2.2中的萃取方法進(jìn)行萃取，并記錄萃余相A水相、萃取相A乙酸乙酯相的體積。</p><p>　　2.2.3 萃取相中黃酮含量的測(cè)定</p><p>　　2.2.3.1繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線</p><p>　　吸取0.00、1.00、3.00、4.00蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，相當(dāng)于0.00、0.20、0.40、0.60、

83、0.80無(wú)水蘆丁，分別置于25ml具塞比色管中，補(bǔ)水至約10ml,加1.0ml亞硝酸鈉溶液，混勻，放置6min，加1.0ml硝酸鋁溶液，混勻，放置6min,加4.0ml氫氧化鈉，再加水至刻度，搖勻，放置15min。用1cm比色皿，以試劑空白調(diào)節(jié)零點(diǎn)，在波長(zhǎng)510ml處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，蘆丁質(zhì)量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。</p><p>　　2.2.3.2萃取相中黃酮含量的測(cè)定</p>&l

84、t;p>　　吸取2.00ml樣品溶液兩份，分別置于25ml具塞比色管中，補(bǔ)水至約10ml,以下步驟按2.3.3.1操作，其中一份不加硝酸鋁溶液，做樣品空白。以試劑空白溶液調(diào)整零點(diǎn)，在波長(zhǎng)510nm處測(cè)定樣品和樣品空白的吸光度，測(cè)得樣品吸光度減去樣品空白吸光度。將所得吸光值帶入2.2.3.1中繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出溶液中總黃酮含量，然后將所得值帶入如下公式計(jì)算出黃酮在干物質(zhì)中的含量：</p><p>　　上式

85、中“2”表示吸取的2.00ml樣品的體積</p><p>　　2.2.4 萃取相中黃酮抗氧化活性研究</p><p>　　2.2.4.1 DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)</p><p>　　2.2.4.1.1 實(shí)驗(yàn)原理：</p><p>　　DPPH法是一種篩選自由基清除劑的簡(jiǎn)便方法，在國(guó)內(nèi)外有著廣泛的應(yīng)用。該分析方法的分析原理是依據(jù)DPPH自由基可

86、溶于甲醇溶中而呈現(xiàn)深紫色，在517nm波長(zhǎng)處有極大吸收值。當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí)，自由基清除劑會(huì)提供質(zhì)子以還原DPPH自由基而使其紫色逐漸消失，從而導(dǎo)致其吸光值下降，據(jù)此可檢測(cè)樣品的清除自由基能力。由于DPPH法為我們提供了一個(gè)試樣與穩(wěn)定自由基反應(yīng)的信息，因而該法廣泛用于自由基清除劑的篩選研究工作。</p><p>　　2.2.4.1.2 試驗(yàn)方法</p><p>　　清除DPPH自由基使

87、用的是Archana Banerjee等的方法。準(zhǔn)確稱取DPPH·試劑10mg于小燒杯中，用無(wú)水甲醇溶解，定量移入250mL棕色容量瓶中，用無(wú)水甲醇稀釋至刻度，搖勻，得0.004%DPPH·溶液，置于4℃冰箱中冷藏備用。</p><p>　　將3ml，0.004%的DPPH自由基甲醇溶液加入到2mL不同濃度的樣品中。室溫放置30分鐘，于517 nm處測(cè)定吸光值，吸光值越小，表明自由基清除能力越

88、強(qiáng)。根據(jù)下列公式計(jì)算清除率：</p><p>　　% 清除率 =( 1-A1/A0)×100%</p><p>　　其中 A0:空白在517nm處吸光值</p><p>　　Al :樣品在517nm處吸光值</p><p>　　用兒茶素（95％）作為對(duì)照，方法同上。</p><p>　　2.2.4.2羥自由基

89、清除實(shí)驗(yàn)</p><p>　　2.2.4.2.1 實(shí)驗(yàn)原理：</p><p>　　利用H2O2和Fe2＋混合發(fā)生Fenton反應(yīng)，生成具有很高反應(yīng)活性的·OH。反應(yīng)原理如下:</p><p>　　Fe2+ + H202 → Fe3+ +·OH</p><p>　　Fe2+ + H2O2 → Fe3+ +HOO·+

90、H+</p><p>　　HOO·+ H202 →O2+ H2O+＋·OH</p><p>　　因?yàn)榉翌D試劑可以方便的生成羥基自由基，所以被廣泛的應(yīng)用于自由基學(xué)的研究和應(yīng)用領(lǐng)域中。鄰二氮菲-Fe2+水溶液因被經(jīng)自由基氧化為鄰二氮菲-Fe3+，在51Onm處的吸光度減小。加入H2O2前加入羥自由基抑制劑，則Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的經(jīng)自由基被抑制或部分抑制，體系在510nm處

91、的吸光度降低程度相應(yīng)減小。因而可以利用吸光度值的變化來(lái)反映樣品清除羥自由基的能力。</p><p>　　2.2.4.2.2試驗(yàn)方法</p><p>　　取2mlPH＝7.4的磷酸緩沖液，加1ml 1.5nmol/L 鄰二氮菲，充分混勻，加入1.5nmol/L的FeSO4每加一管，立即混勻，加入不同濃度的樣品溶液，混勻，補(bǔ)充各管至8ml，37℃,1hour ,3000r/min 離心10mi

92、n ,上清液510nm下測(cè)得吸光度值。同時(shí)做損傷管以及未損傷管，測(cè)定吸光度值。吸光度值越小，清除能力越強(qiáng)。損傷管用1ml0.02％的H2O2代替樣品，未損傷管用1ml蒸餾水代替樣品。根據(jù)下列公式計(jì)算清除率：</p><p>　?。?清除率＝[1-(A2-A1)/(A0-A1)]×100</p><p>　　其中：A0 未損傷管的吸光度值</p><p>　

93、　A1 損傷管的吸光度值</p><p>　　A2 樣品去樣品本身顏色空白后的吸光度值</p><p>　　用兒茶素（95％）作為對(duì)照，方法同上。</p><p><b>　　2.3結(jié)果與討論</b></p><p>　　2.3.1 不同萃取系統(tǒng)對(duì)Y相中黃酮萃取效果的影響</p><p>　　2.

94、3.1.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線</p><p>　　根據(jù)2.2.3.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法，以吸光度為縱坐標(biāo)，蘆丁質(zhì)量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖2-1。得標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=0.339X+0.0034 R2 =0.9992</p><p>　　圖2-1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線</p><p>　　Fig.2-1 The of standard curve Rutin</p&g

95、t;<p>　　2.3.1.2 三種萃取系統(tǒng)萃取效果比較</p><p>　　根據(jù)2.2.3.2中黃酮含量的測(cè)定方法，測(cè)得每個(gè)萃取系統(tǒng)萃取所得各相中所含黃酮在干物質(zhì)中的含量如下表2-1所示： </p><p>　　表2-1 各萃取系統(tǒng)相黃酮含量</p><p>　　Tab. 2-1 The flavonoids content of extractio

96、n system</p><p>　　從以上三表可以得出三種萃取系統(tǒng)對(duì)Y相進(jìn)行萃取，黃酮在干物質(zhì)中的含量大小依次為：乙酸乙酯-水-乙酸＞乙酸乙酯-水＞正丁醇-水。從而說(shuō)明萃取效果乙酸乙酯-水-乙酸系統(tǒng)的萃取效果最好，其次是乙酸乙酯-水系統(tǒng)，最差的是正丁醇-水系統(tǒng)。乙酸乙酯-水萃取系統(tǒng)與乙酸乙酯-水-乙酸萃取系統(tǒng)相比較，加乙酸的主要目的是增加Y相的極性，增大分配系數(shù)提高萃取效果，同時(shí)加入乙酸也有助于花青素類化合物的

97、提取，加入乙酸的量必須控制好，避免甙鍵發(fā)生水解。</p><p>　　由于黃酮類化合物因其結(jié)構(gòu)和來(lái)源不同，溶解特性差異較大，對(duì)甙類和極性較大的甙元常用一些極性較強(qiáng)的溶劑如甲醇、乙醇、正丁醇等進(jìn)行提取，而黃酮甙元一般采用乙醚、氯仿、乙酸乙酯等極性較小的溶劑進(jìn)行提取，通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)可以得出乙酸乙酯-水的效果明顯好于正丁醇-水，由此可以初步推斷出甜茶黃酮類化合物中含有豐富的黃酮甙。</p><p>

98、;　　2.3.1.3 三種萃取系統(tǒng)回收率比較</p><p>　　以各萃取相中黃酮含量相對(duì)于Y相中黃酮含量為基準(zhǔn)，計(jì)算三種萃取系統(tǒng)萃取甜茶黃酮的回收率，結(jié)果如下表2-2：</p><p>　　表2-2三種萃取系統(tǒng)回收率對(duì)比</p><p>　　Tab. 2-2 The extraction rate of the three extraction systems c

99、omparison</p><p>　　由上述可知雖然乙酸乙酯-水-乙酸的提取效果最好，其次是乙酸乙酯-水，但是從上表中可知它們的回收率都不高。乙酸乙酯-水系統(tǒng)回收率偏低主要是因?yàn)樵谧鲂D(zhuǎn)蒸發(fā)試驗(yàn)過(guò)程中選擇了2000ml的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶，雖然2000ml的容量瓶蒸發(fā)可以加快蒸發(fā)速度，但是在移液潤(rùn)洗的過(guò)程中卻很難洗干凈瓶子導(dǎo)致?lián)p失了部分的黃酮，最終導(dǎo)致了提取率偏小的結(jié)果。乙酸乙酯-水-乙酸系統(tǒng)在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的過(guò)程中與正丁醇

100、-水系統(tǒng)同樣選用了250ml的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶，但是又黃褐色的絮凝物出現(xiàn)不溶于水但是可用乙酸乙酯復(fù)溶，并且瓶?jī)?nèi)有很重的乙酸味，懷疑是由于滴加的乙酸過(guò)多導(dǎo)致甙鍵水解從而影響回收率。</p><p>　　2.3.2 甜茶黃酮抗氧化活性</p><p>　　2.3.2.1 DPPH自由基清除試驗(yàn)</p><p>　　DPPH法廣泛的應(yīng)用于測(cè)定植物提取物自由基清除能力的試驗(yàn)。在甲

101、醇溶液中，DPPH是一種呈紫紅色的穩(wěn)定自由基，在517nm處有最大吸收峰。當(dāng)溶液中存在抗氧化劑時(shí)，抗氧化劑能夠給DPPH自由基提供氫原子使其發(fā)生褪色，從而使吸光值變小，顏色越淺表明抗氧化劑的抗氧化能力越強(qiáng)。因此，通過(guò)測(cè)定樣品對(duì)DPPH自由基的清除能力可以反映其抗氧化活性的強(qiáng)弱。配制濃度為0.05mg/ml、0.01mg/ml、0.02mg/ml、0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml的2.2.2.2萃取所得的A乙酸乙酯相

102、與Y相及兒茶素，按照2.3.4.1做DPPH羥基自由基清除實(shí)驗(yàn)，以濃度為橫坐標(biāo)，清除率為縱坐標(biāo)作圖結(jié)果見(jiàn)圖2-2：</p><p>　　圖2-2 DPPH清除作用濃度-清除率曲線</p><p>　　Fig.2-2 DPPH radical-scavenging activities of concentration-clearance rate curve</p><

103、p>　　通過(guò)圖2-2可以直觀的看出：Y相與2.2.2.2萃取所得的A乙酸乙酯相都具有跟兒茶素相近的自由基清除能力，表明Y相與A乙酸乙酯相都具有與兒茶素相近的抗氧化性。從0.1mg/mL的濃度開(kāi)始，A乙酸乙酯相的清除率超過(guò)兒茶素，Y相的清除率始終小于兒茶素的清除能力，在三種物質(zhì)之間做比較可得到其清除能力大小依次為：A乙酸乙酯相＞兒茶素＞Y相。A乙酸乙酯相與Y相之間作比較可以發(fā)現(xiàn)了隨著總黃酮含量的提高，其DPPH自由基清除能力隨之增強(qiáng)

104、，從而可以初步判斷出甜茶中的黃酮具有良好的抗氧化性。</p><p>　　2.3.2.2羥自由基清除試驗(yàn)</p><p>　　配制濃度為0.05mg/ml、0.01mg/ml、0.02mg/ml、0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml的甜茶黃酮萃取液A乙酸乙酯相與Y相及兒茶素，按照2.2.4.2做羥自由基清除實(shí)驗(yàn)，以濃度為橫坐標(biāo)，清除率為縱坐標(biāo)作圖結(jié)果見(jiàn)圖2-3。</

105、p><p>　　圖2-3羥自由基清除作用濃度-清除率曲線</p><p>　　Fig.2-1 Hydroxyl radical-scavenging activities of concentration-clearance rate curve</p><p>　　通過(guò)圖2-2可以看出：從0.01mg/ml開(kāi)始三條曲線都呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，即隨著濃度的增大兒茶素與Y相及A乙

106、酸乙酯相的清除率逐漸升高，并且從曲線上反映出其清除率的大小始終是A乙酸乙酯相＞兒茶素＞Y相，這一結(jié)果與DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)反映出的規(guī)律一致。A乙酸乙酯相與Y相之間，同樣也反應(yīng)出隨著樣液中黃酮含量的升高，其羥自由基清除能力也隨之提高，從而進(jìn)一步說(shuō)明了隨著提取物中總黃酮的提高提取物的羥自由基清除能力隨之增強(qiáng)，也反映出了甜茶中的黃酮類物質(zhì)具有很強(qiáng)的自由基清除能力，是一種良好的抗氧化劑。</p><p><b&g

107、t;　　2.4本章小結(jié)</b></p><p>　　本章主要對(duì)三種不同萃取體系提取甜茶中黃酮類化合物進(jìn)行研究。綜合分析不同萃取體系對(duì)甜茶中黃酮類物質(zhì)萃取的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：正丁醇-水系統(tǒng)萃取效果最差，萃取后的提取液中的黃酮含量只比Y相中的黃酮含量升高了2.31%；其次是乙酸乙酯-水系統(tǒng)，比Y提中黃酮含量升高了31.1%，黃酮在干物質(zhì)中的含量達(dá)到了58％；效果最好的是乙酸乙酯-水-乙酸系統(tǒng)，黃酮含量比

108、Y相提高了35.6％，黃酮在干物質(zhì)中的含量達(dá)到了62.5％。通過(guò)比較得出采用乙酸乙酯-水-乙酸系統(tǒng)萃取甜茶中黃酮類化合物的效果最好。同時(shí)也反映出采用乙酸乙酯萃取效果明顯好于正丁醇，根據(jù)黃酮類物質(zhì)溶解性規(guī)律，可以初步判斷出甜茶中的黃酮類物質(zhì)含有大量的黃酮甙。</p><p>　　通過(guò)DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)與羥自由基實(shí)驗(yàn)，得出了兒茶素與Y相及A乙酸乙酯相的自由基清除能力依次為：A乙酸乙酯相＞兒茶素＞Y相。從而說(shuō)明甜茶