江蘇地區(qū)大宗淡水魚養(yǎng)殖池塘氣單胞菌分離、鑒定和遺傳多樣性研究.pdf

1、本研究通過(guò)RS選擇性培養(yǎng)基,從采集自江蘇大宗淡水魚養(yǎng)殖池塘的未發(fā)病池塘和發(fā)病池塘的樣品中共分離到182株細(xì)菌。氧化酶、觸酶和O/F實(shí)驗(yàn)分析顯示,其中152株為疑似氣單胞菌。
　　 運(yùn)用16S rRNA通用引物測(cè)得實(shí)驗(yàn)菌株的16S rRNA的部分序列,在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中用NCBI-BLAST軟件進(jìn)行同源性檢索,結(jié)果顯示152株實(shí)驗(yàn)菌株中有89株為氣單胞菌屬,其中有63株可鑒定到種的水平(63/89,70.8％)。再運(yùn)用相同方

2、法根據(jù)氣單胞菌的gyrB基因?qū)κＯ碌?6株用16S rRNA序列無(wú)法鑒定至種的菌株進(jìn)行鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn),不管是在正常養(yǎng)殖塘口中還是在發(fā)病池塘中,以維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)分布最廣泛、數(shù)量最多(未發(fā)病池塘菌株:31/37,83.8％；發(fā)病池塘菌株:39/52,75％),而嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)分布不廣泛、數(shù)量也較少(未發(fā)病池塘菌株:1/37,2.7％；發(fā)病池塘菌株:10/52,19.

3、2％)。除此之外,還分離出少量的殺鮭氣單胞(Aeromonas salmonicida)、中間氣單胞菌(Aeromonas media)和簡(jiǎn)達(dá)氣單胞菌(Aeromonas jandaei)。
　　 利用PCR法檢測(cè)89株氣單胞菌氣溶素(aer)、溶血素(hly)和細(xì)胞興奮性腸毒素(alt)三種毒力基因,結(jié)果發(fā)現(xiàn),89株氣單胞菌中含有氣溶素基因的有20株,占?xì)鈫伟倲?shù)的22.5％；含有溶血素基因的有34株,占?xì)鈫伟倲?shù)的38.

4、2％；含有細(xì)胞興奮性腸毒素基因的有34株,占?xì)鈫伟倲?shù)的38.2％。其中37株環(huán)境菌株中有9株未擴(kuò)出這3種毒力基因的目的條帶,其余28株致病性氣單胞菌均擴(kuò)增出數(shù)量不等的毒力基因條帶。28株環(huán)境菌株的毒力基因型主要以2種及以上的基因型組合為主。52株病原菌株中有19株未擴(kuò)增出這3株毒力基因的目的條帶,其余33株致病性氣單胞菌均擴(kuò)增出數(shù)量不等的毒力基因條帶。33株病原菌株的毒力基因型組合無(wú)明顯規(guī)律。
　　 由于A.veronii在

5、大宗淡水魚養(yǎng)殖池塘中分布廣泛,因此利用A.veronii的16s rRNA序列和管家基因序列對(duì)其進(jìn)行遺傳多樣性分析。從基于16S rRNA基因序列的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹上可知,常州地區(qū)未發(fā)病池塘和發(fā)病池塘分離得到的A.veronii可分為兩大遺傳類群,在第一類群中,共有30株A.veronii,第二類群中共有14株A.veronii,未發(fā)病池塘和發(fā)病池塘的A.veronii交錯(cuò)分布在系統(tǒng)發(fā)育樹上。常州、無(wú)錫和鹽城三個(gè)地區(qū)不同發(fā)病池塘分離得到的

6、A.veronii主要分為三大遺傳類群,第一類群中共有20株A.veronii,其中常州地區(qū)分離得到的有11株,無(wú)錫地區(qū)的有8株,鹽城地區(qū)的有1株；在第二類群中共有11株A.veronii,其中常州地區(qū)分離得到的有6株,無(wú)錫地區(qū)的有4株,鹽城地區(qū)的有1株；在第三類群中共有7株A.veronii,其中常州地區(qū)分離得到的有4株,無(wú)錫地區(qū)的有2株,鹽城地區(qū)的有1株,三大遺傳類群中A.veronii多是相同地區(qū)的聚在一起。從基于聯(lián)合16s rR

7、NA、gyrB和dna.J基因序列的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹上可知,常州地區(qū)未發(fā)病池塘和發(fā)病池塘分離得到的A.veronii可分為四大遺傳類群,第一類群中共有18株A.veronii,其中未發(fā)病池塘中分離的有10株,發(fā)病池塘中分離的有8株；第二類群中共有15株A.veronii,其中未發(fā)病池塘中分離的有11株,發(fā)病池塘中分離的有4株；在第三類群中共有6株A.veronii,2株為未發(fā)病池塘水體分離,1株為健康團(tuán)頭魴腸道內(nèi)容物分離的,3株為發(fā)病池塘

8、魚體分離的；第四類群中,健康團(tuán)頭魴腸道IA0804與病樣FA0903,健康團(tuán)頭魴腸道IA0815與水樣WA0916分別聚類。不同地區(qū)發(fā)病池塘分離得到的A.veronii分為兩大遺傳類群,第一類群中共有22株A.veronii,其中常州地區(qū)分離得到的有12株,無(wú)錫地區(qū)的有10株；在第二類群共有16株A.veronii,其中常州地區(qū)分離得到的有9株,無(wú)錫地區(qū)的有4株,而鹽城地區(qū)發(fā)病池塘分離的有3株,不同地區(qū)發(fā)病池塘分離得到的A.veroni