青蝦咽側(cè)體抑制激素(Allatostatin,AST)基因全長cDNA序列的克隆及表達(dá)分析.pdf

1、青蝦，學(xué)名日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)，屬節(jié)肢動(dòng)物門(Arthropoda)，甲殼綱(Crustacea)，十足目(Decapoda)，長臂蝦科(Palaemonidae)、沼蝦屬(Macrobrachium)，廣泛分布于全國各地。具有病害少、生長快、營養(yǎng)豐富等優(yōu)點(diǎn)，是我國淡水蝦蟹類的重要養(yǎng)殖品種。近年來隨著青蝦累代養(yǎng)殖規(guī)模逐漸擴(kuò)大，出現(xiàn)了種質(zhì)退化，規(guī)格小、性早熟等現(xiàn)象，嚴(yán)重影響了青蝦的養(yǎng)殖效益。因此，開

2、展青蝦蛻皮及生殖發(fā)育相關(guān)功能和機(jī)制的研究十分迫切。節(jié)肢動(dòng)物門的昆蟲和甲殼動(dòng)物都具有周期性蛻皮等相似的生理特性。首先在昆蟲中發(fā)現(xiàn)的咽側(cè)體抑制激素具有調(diào)節(jié)蛻皮和生殖的重要功能。甲殼動(dòng)物腦神經(jīng)細(xì)胞分泌的甲殼動(dòng)物咽側(cè)體抑制激素(Allatostatin，AST)神經(jīng)肽也具有促進(jìn)蛻皮、性腺成熟、卵成熟以及調(diào)控生殖等重要功能。因此本文以青蝦腦組織為材料，對(duì)咽側(cè)體抑制激素(AST)基因全長cDNA序列進(jìn)行了克隆，并檢測(cè)了AST基因在成體青蝦不同組織中

3、的表達(dá)，以期為青蝦AST基因相關(guān)功能的研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為青蝦蛻皮機(jī)制及生殖發(fā)育的研究提供參考。
　　 本研究在傳統(tǒng)基因克隆方法的基礎(chǔ)上采用分段克隆的方法克隆了青蝦AST基因的全長cDNA序列，即把青蝦AST基因全長cDNA序列分成幾個(gè)片段分別擴(kuò)增。本實(shí)驗(yàn)共擴(kuò)增了4段中間片段cDNA，經(jīng)比對(duì)拼接后得到AST基因cDNA的全部中間序列，再與cDNA3'末端及5'末端拼接得出AST基因的全長cDNA序列。青蝦AST基因cDNA序列

4、全長2995bp，包括242bp的5'非編碼區(qū)(UTR)，647bp的3'UTR，2106bp的開放閱讀框(ORF)。在poly(A)上游具有明顯的加尾信號(hào)AATAAA，開放閱讀框共編碼701個(gè)氨基酸多肽前體，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子量為78.7kDa，理論等電點(diǎn)為9.15。氨基酸多肽前體包括27個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽和674個(gè)氨基酸組成的成熟肽。成熟肽可加工成35個(gè)AST多肽，這些多肽在C末端都具有相同的Y/FXFGL-amide結(jié)構(gòu)，屬于典型的

5、A型-AST，與昆蟲綱蜚蠊目昆蟲的AST多肽結(jié)構(gòu)特征相同。將青蝦的AST多肽與克氏螯蝦(Procambarus clarkii)、三葉真蟹(Carcinus maenas)、斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeus monodon)、大海蝦(Panulirus interruptus)、羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)的AST多肽比對(duì)，結(jié)果顯示保守氨基酸為Tyr、Phe、Gly、Leu幾種，保守的多肽為AST-19，26，2

6、9，青蝦特有的多肽為AST-3，8，16，20，24。部分昆蟲和甲殼動(dòng)物AST蛋白相似度比對(duì)顯示，相似度均在60％以上，表明AST在無脊椎動(dòng)物的進(jìn)化中是相對(duì)保守的。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，甲殼動(dòng)物和昆蟲各自聚為一支，與傳統(tǒng)分類學(xué)分類結(jié)果相吻合，其中青蝦與羅氏沼蝦最先聚在一起，親緣關(guān)系最近。
　　 采用熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)分析了AST基因在青蝦腦、腸道、肝臟、心臟、精巢、卵巢6種組織中的表達(dá)情況。以β-actin基因?yàn)?/p>

7、內(nèi)參基因。結(jié)果顯示，AST mRNA在6種組織中均有表達(dá)，表達(dá)水平依次為:肝臟＞腸道＞精巢＞腦＞心臟＞卵巢。已有的研究結(jié)果表明，AST多肽除了具有影響甲殼動(dòng)物蛻皮和生殖的作用外，還能影響腸道和心臟的收縮頻率和幅度。本研究中，AST在肝臟中檢出量最高，與其他組織表達(dá)量均達(dá)到極顯著差異，其次在腸道和精巢中也具有較高的表達(dá)量，在腦和心臟中的表達(dá)量相對(duì)較低，在卵巢的表達(dá)量最低，組織間差異不顯著。
　　 本研究首次克隆得到了青蝦AST基因