牙鲆堿性磷酸酶基因的調(diào)控序列及其與甲狀腺激素和維甲酸的關(guān)系.pdf

1、堿性磷酸酶(ALP)是一種單脂磷酸水解酶，它本身是一種膜結(jié)合金屬糖蛋白，由兩個(gè)亞單位組成，有眾多的催化底物和復(fù)雜功能，除了少數(shù)植物外，廣泛分布于大多數(shù)生物體內(nèi)。ALP由一個(gè)多基因家族編碼，目前人和老鼠的堿性磷酸酶基因均已被克隆。人腸特異性堿性磷酸酶基因(IAP)作為甲狀腺激素受體的下游靶基因，受甲狀腺激素T3的正向調(diào)控。甲狀腺激素是多效性因子，在魚類變態(tài)中，對其發(fā)育和生理功能等多方面起著非常重要的作用。
　　 與哺乳動(dòng)物研究相比

2、，水生動(dòng)物ALP的研究較多的集中于組織學(xué)、酶的生化性質(zhì)等方面，關(guān)于魚類變態(tài)過程中ALP的表達(dá)和調(diào)控的報(bào)道還不多。近幾年，本實(shí)驗(yàn)室圍繞ALP進(jìn)行了一系列的研究，研究表明，ALP的表達(dá)與變態(tài)中的形態(tài)與功能變化有密切關(guān)系，且在牙鲆仔魚變態(tài)中期添加外源性甲狀腺素T4可以有效上調(diào)ALP表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)室還克隆了ALP的全基因，根據(jù)其結(jié)構(gòu)特征及mRNA的組織分布特點(diǎn)，認(rèn)為克隆的牙鲆ALP屬于組織非特異性ALP，利用生物信息學(xué)對ALP的5'調(diào)控區(qū)及第一內(nèi)

3、含子進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)5’調(diào)控區(qū)存在一個(gè)視黃酸應(yīng)答元件/甲狀腺索應(yīng)答元件(RARE/TRE)，第一個(gè)內(nèi)含子存在兩個(gè)潛在的啟動(dòng)子位點(diǎn)和一個(gè)增強(qiáng)子，含有視黃酸受體(RXR)等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。并進(jìn)一步構(gòu)建報(bào)告基因表達(dá)載體，通過脂質(zhì)體方法轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，檢測了5’調(diào)控區(qū)和第一內(nèi)含子的啟動(dòng)子活性。
　　 為了更深入確定5'調(diào)控區(qū)和第一內(nèi)含子兩個(gè)調(diào)控序列的功能，本研究運(yùn)用DNA重組技術(shù)將PCR擴(kuò)增得到的牙鲆堿性磷酸酶基因的5’調(diào)控區(qū)序列、第

4、一內(nèi)含子序列、5'調(diào)控區(qū)-882～-107bp序列分別插入啟動(dòng)子缺失的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白表達(dá)載體pAcGFP1-1中，分別構(gòu)建成重組載體pAcGFP1-5'ALP、pAcGFP1-Intronl及pAcGFP1-NTR，并將第一內(nèi)含子插入已構(gòu)建好的重組載體pAcGFP1-5'ALP中，構(gòu)建成含5'調(diào)控區(qū)和第一內(nèi)含子調(diào)控序列的順序串聯(lián)型的報(bào)告基因表達(dá)載體pAcGFP1-AI。而后通過脂質(zhì)體介導(dǎo)重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)并檢

5、測熒光信號。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，24h后在倒置熒光顯微鏡下可看到轉(zhuǎn)染不同重組質(zhì)粒的孔板細(xì)胞發(fā)出不同強(qiáng)度的綠色熒光信號，其中轉(zhuǎn)染pAcGFP1-AI后的熒光信號強(qiáng)度最強(qiáng)；48h后可以看出熒光信號隨時(shí)間的延長而增強(qiáng)。結(jié)果表明，牙鲆堿性磷酸酶基因5'調(diào)控區(qū)和第一個(gè)內(nèi)含子序列均具有啟動(dòng)子活性，第一內(nèi)含子與5’調(diào)控區(qū)存在協(xié)同效應(yīng)，兩者協(xié)同能增強(qiáng)基因的表達(dá)。
　　 為了解甲狀腺激素及維甲酸對牙鲆堿性磷酸酶調(diào)控序列啟動(dòng)子活性的調(diào)節(jié)作用，轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞2

6、4h時(shí)，在轉(zhuǎn)染了四種重組質(zhì)粒的孔板中分別都加入0、50、75和100nM4個(gè)不同終濃度的甲狀腺激素T3、甲狀腺素T4或0、10、50、100nM終濃度的全反式視黃酸(ATRA),24h后再次進(jìn)行觀測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著T3及ATRA處理濃度逐漸增高，轉(zhuǎn)染pAcGFP1-5'ALP、pAcGFP1-Intronl及pAcGFP1-AI報(bào)告基因表達(dá)載體的細(xì)胞的綠色熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，而T4處理后的轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光強(qiáng)度沒有變化。該結(jié)果表明，甲狀腺激素

7、T3、全反式視黃酸均可正向調(diào)控牙鲆堿性磷酸酶基因調(diào)控序列的啟動(dòng)子活性，甲狀腺T4對牙鲆堿性磷酸酶基因調(diào)控序列的啟動(dòng)子活性的調(diào)節(jié)作用并不明顯。
　　 另對轉(zhuǎn)染報(bào)告基因表達(dá)載體pAcGFP1-NTR細(xì)胞的藥物處理結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，不同濃度ATRA處理對轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光強(qiáng)度沒有影響，而T3、T4對轉(zhuǎn)染細(xì)胞熒光強(qiáng)度的調(diào)節(jié)不與處理濃度相關(guān)。結(jié)果表明，5’調(diào)控區(qū)-882～-107bp序列不含應(yīng)答維甲酸的調(diào)控元件。
　　 以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果為今后