榨菜和紫甘藍(lán)嫁接嵌合體生長(zhǎng)發(fā)育特性與不定器官起源的研究.pdf

1、榨菜(Brassica juncea Coss.var.tumida Tsen et Lee)和紫甘藍(lán)(B.oleracea var.capitata L.)屬于十字花科蕓薹屬植物，是重要的蔬菜作物。以榨菜和紫甘藍(lán)為材料通過(guò)試管離體嫁接可以獲得種間嵌合體。本論文以榨菜和紫甘藍(lán)種間嵌合體為研究材料，通過(guò)植物學(xué)、細(xì)胞學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)等方法，研究了嵌合體營(yíng)養(yǎng)時(shí)期和生殖時(shí)期生長(zhǎng)發(fā)育特性；通過(guò)嵌合體光合特性研究，探討嫁接“優(yōu)勢(shì)”與兩種遺傳

2、型的細(xì)胞系之間的相互關(guān)系；通過(guò)嵌合體不同部位的不定器官再生研究，揭示了植物不定器官的起源和發(fā)生規(guī)律，以及不同細(xì)胞層間的相互影響。本研究為植物育種學(xué)和植物發(fā)育學(xué)研究提供了新思路和新方法，為細(xì)胞互作機(jī)制研究提供了良好的試驗(yàn)體系，也為利用嵌合體改良植物性狀以及生產(chǎn)實(shí)踐應(yīng)用提供理論依據(jù)，主要研究結(jié)果如下： 1.在形態(tài)學(xué)、細(xì)胞水平、蛋白質(zhì)水平和分子水平上對(duì)榨菜和紫甘藍(lán)的種間嵌合體進(jìn)行了分析。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)嵌合體的形態(tài)特征在具有了兩個(gè)親本特點(diǎn)

3、的基礎(chǔ)上，其形態(tài)發(fā)生了一定變化。利用掃描和透射電鏡觀察葉片表皮和葉肉細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)嵌合體的氣孔密度超過(guò)兩個(gè)親本，葉綠體、淀粉粒等的形態(tài)指標(biāo)基本處于兩個(gè)親本之間。通過(guò)可溶性蛋白質(zhì)的SDS-PAGE電泳圖譜觀察到嵌合體產(chǎn)生了特異性條帶。分子水平上的RAPD和特異引物PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，嵌合體沒(méi)有產(chǎn)生其特異性條帶。這些研究結(jié)果證明嵌合體中兩種基因型不同的細(xì)胞系之間存在著相互作用，使嵌合體在形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)和生物化學(xué)特性發(fā)生了改變。另外，嵌

4、合體采用離體保存的方法，用1/2MS培養(yǎng)基可以長(zhǎng)期保存。利用腋芽繁殖途徑對(duì)嵌合體進(jìn)行無(wú)性繁殖，這種方法可以使后代植株保持與母株一樣的嵌合狀態(tài)。用1/2MS+1mg/LBA培養(yǎng)基擴(kuò)繁時(shí)，周緣嵌合體轉(zhuǎn)化為扇形嵌合體和混合型嵌合體的比例分別是8.2％和2.4％。而用1/2MS+0.1mg/LBA時(shí)周緣嵌合體基本不會(huì)產(chǎn)生其它類(lèi)型的嵌合體，但腋芽生長(zhǎng)速度較慢。田間植株腋芽離體繁殖所用的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2MS+1mg/LBA，但腋芽的誘導(dǎo)率比試管苗

5、低. 2.從光合作用、葉綠素?zé)晒狻⑷~綠素含量、Rubisco的活性以及Rubisco大亞基和小亞基基因的轉(zhuǎn)錄水平等進(jìn)行了測(cè)定分析。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，周緣嵌合體TCC(LI-LII-LIII=TCC，LI-莖尖分生組織層最外層；LII-中間層；LIII-最內(nèi)層.T表示榨菜，C表示紫甘藍(lán))的凈光合速率為18.09μmolCO2·m-2·s-1，與親本榨菜相當(dāng)，但比親本紫甘藍(lán)高出24％。而嵌合體的氣孔導(dǎo)度和胞間CO2濃度顯著高于兩個(gè)親本。

6、葉綠素?zé)晒鈪?shù)中光系統(tǒng)II實(shí)際的量子效率(φPSII)和光化學(xué)猝滅系數(shù)(qP)在榨菜中最高，而嵌合體和紫甘藍(lán)的這兩個(gè)參數(shù)基本一致。葉綠素含量測(cè)定后發(fā)現(xiàn)，嵌合體的葉綠素a和b的總含量與榨菜的比較接近，比紫甘藍(lán)高97％。TCC嵌合體Rubisco酶的初始活性和總活性處于榨菜(最高)和紫甘藍(lán)(最低)之間，為1.76和3.75μmolCO2·g-1·min-1。而TCC嵌合體的Rubisco酶大亞基和小亞基基因的相對(duì)表達(dá)量與榨菜和紫甘藍(lán)相比明顯

7、增高。以上結(jié)果說(shuō)明，與TCC嵌合體光合機(jī)構(gòu)的層源親本——紫甘藍(lán)相比，其葉綠素含量升高、Rubisco酶的活性以及其大小亞基基因表達(dá)的增強(qiáng)導(dǎo)致其凈光合速率的提高。可見(jiàn)，TCC嵌合體的異源表皮(來(lái)自榨菜)對(duì)其內(nèi)部光合組織光合能力的改善有很大的促進(jìn)作用。 3.對(duì)榨菜和紫甘藍(lán)種間周緣嵌合體TCC的生殖器官和生殖特性等方面進(jìn)行了研究。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TCC嵌合體的有性生長(zhǎng)發(fā)育與紫甘藍(lán)相近，具有嚴(yán)格的綠體春花特性。其抽薹開(kāi)花習(xí)性和花序、花冠形

8、態(tài)也與紫甘藍(lán)類(lèi)似，但在異源表皮——榨菜的影響下發(fā)生了改變，很多形態(tài)指標(biāo)，如花蕾長(zhǎng)、短軸長(zhǎng)度，花瓣的長(zhǎng)、寬，雄蕊、雌蕊的長(zhǎng)度以及花粉粒的大小等都基本介于榨菜和紫甘藍(lán)相應(yīng)指標(biāo)的中間。此外，對(duì)嵌合體進(jìn)行蕾期自交、雜交后，嵌合體可以產(chǎn)生果實(shí)但不能產(chǎn)生種子。從以上的研究可以說(shuō)明，在TCC嵌合體的有性生殖生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中LI(榨菜)與LII和LIII(紫甘藍(lán))之間的相互作用使TCC嵌合體的生殖器官和生殖特性相對(duì)于親本發(fā)生了較大變化。從嵌合體花冠的大小

9、和形狀改變以及產(chǎn)生無(wú)籽果實(shí)的角度來(lái)看，嵌合體在花卉和瓜類(lèi)等作物育種上有很大的應(yīng)用潛力。 4.以榨菜和紫甘藍(lán)種間周緣嵌合體TCC的莖段和葉片為外植體誘導(dǎo)了不定芽的再生。利用形態(tài)標(biāo)記和分子生物學(xué)方法鑒定分析不定芽的起源。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，莖段上葉腋處不定芽的誘導(dǎo)頻率隨著MS培養(yǎng)基中BA濃度的增加而升高，而莖段基部不定芽的誘導(dǎo)頻率在含有不同濃度BA的培養(yǎng)基中沒(méi)有差異。葉腋處產(chǎn)生的不定芽絕大多數(shù)是榨菜(TTT)，只有4個(gè)嵌合體的產(chǎn)生，

10、由此可知：與LⅡ和LⅢ相比，這些不定芽更多的起源于LⅠ層。從莖段基部產(chǎn)生的不定芽全部為紫甘藍(lán)(CCC)，說(shuō)明這些不定芽起源于LⅡ或LⅢ，或者是兩層共同參與的結(jié)果。葉片外植體上不定芽的再生頻率在三種不同的NAA和BA組合的培養(yǎng)基之間存在著顯著的差異。葉片切塊邊緣再生的不定芽絕大多數(shù)是紫甘藍(lán)(CCC)，70個(gè)不定芽中只有2個(gè)是嵌合體。從這一結(jié)果可以推出：葉片上再生的不定芽絕大多數(shù)是由LⅡ或(和)LⅢ參與形成的，LⅠ參與的幾率較低。另外由試驗(yàn)

11、發(fā)現(xiàn)，再生的嵌合體類(lèi)型與其親本TCC的類(lèi)型相比完全不同。從上述的研究結(jié)果可以推出，不定芽的起源會(huì)因?yàn)橥庵搀w從供體植株上的來(lái)源不同而發(fā)生改變，而且嵌合體是多細(xì)胞甚至是多組織參與起源的。 5.同樣以周緣嵌合體TCC的葉片和莖段為外植體誘導(dǎo)不定根。TCC嵌合體葉片和莖段上的誘導(dǎo)頻率分別為94％和86％，顯著高于它的親本。其中榨菜葉片和莖段不定根的誘導(dǎo)頻率分別為25％和38％，而紫甘藍(lán)分別為73％和47％。另外，每株TCC嵌合體不定根的

12、數(shù)目平均是13.11，平均重量為0.274g，這些指標(biāo)也顯著高于榨菜和紫甘藍(lán)。這些結(jié)果說(shuō)明嵌合體異源LⅠ(表皮)與內(nèi)部LⅡ和LⅢ之間可能存在著正向互作從而改善了嵌合體不定根的再生能力。利用PCR技術(shù)(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))和組織解剖學(xué)觀察來(lái)鑒定不定根的起源部位。鑒定結(jié)果顯示，不定根最終起源于LⅢ。 通過(guò)本論文的研究，可以發(fā)現(xiàn)種間嵌合體的不同發(fā)育時(shí)期和各個(gè)器官的特性都受到兩種基因型不同的細(xì)胞層相互作用的影響，特別是數(shù)量性狀基本介于兩個(gè)親