太行山紅豆衫細(xì)胞系建立及培養(yǎng)因子優(yōu)化研究.pdf

1、上世紀(jì)80年代以來(lái)，人們一直在研究利用紅豆杉細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方法生產(chǎn)紫杉醇，并認(rèn)為是解決天然紅豆杉被保護(hù)后紫杉醇藥源問(wèn)題的最有希望的途徑之一。用于工廠化生產(chǎn)的細(xì)胞系，其生長(zhǎng)性能有兩個(gè)基本要求，一是細(xì)胞或愈傷組織生產(chǎn)率高，二是紫杉醇產(chǎn)率高，即“雙產(chǎn)率”高；技術(shù)上也有兩個(gè)基本要求，一是細(xì)胞系易建立，二是易更新。課題從“雙產(chǎn)率”視角，以太行紅豆杉為材料，通過(guò)篩選基本培養(yǎng)基、激素種類、激素濃度、光溫條件、補(bǔ)加前體等培養(yǎng)因子，以及優(yōu)化培養(yǎng)模式，探討

2、建立和更新細(xì)胞系的新方法和提高紫杉醇含量的新途徑。主要結(jié)果如下： 1.優(yōu)化的主要培養(yǎng)因子的結(jié)果為：外植體以當(dāng)年嫩枝最好，基本培養(yǎng)基B5最優(yōu)，激素組合以2，4-D、NAA、6-BA配合最佳。B5基本培養(yǎng)基，附加1.0 mg/L的2，4-D，1.0mg/L的NAA和0.5～1.0 mg/L的6-BA可高頻率誘導(dǎo)愈傷組織；B5基本培養(yǎng)基，附加1.0mg/L的NAA，0.5mg/L的6-BA，和2.0mg/L的2，4-D可高產(chǎn)率繼代細(xì)胞

3、系。細(xì)胞系在25℃～28℃，黑暗或<500Lx散射光下培養(yǎng)生長(zhǎng)速度快，質(zhì)量好。 2.優(yōu)化的培養(yǎng)模式為：固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)和紙橋培養(yǎng)恰當(dāng)結(jié)合，是快速建立細(xì)胞系的良好模式。外植體在固體培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織，在紫杉醇含量的監(jiān)測(cè)下，對(duì)愈傷組織做液體培養(yǎng)，使細(xì)胞分散和同步化，再做平板看護(hù)培養(yǎng)或紙橋繼代，可快速繁殖細(xì)胞系，生長(zhǎng)率達(dá)0.30 g·g-1·d-1(鮮重)。 3.提出了細(xì)胞系復(fù)壯和更新的技術(shù)環(huán)節(jié)：2～3次繼代后適當(dāng)調(diào)整激素

4、水平，可保持細(xì)胞系活力；通過(guò)原始外植體重建、半固體平板繼代中挑選、液體培養(yǎng)下的細(xì)胞系紙橋平板培養(yǎng)并選擇等，可快速更新細(xì)胞系。 4.培養(yǎng)基中添加氨基酸前體對(duì)愈傷組織的生長(zhǎng)和紫杉醇合成有積極影響，發(fā)現(xiàn)D-苯丙氨酸不僅能使紫杉醇含量得到大幅度提高，也能顯著提高細(xì)胞生長(zhǎng)量，“雙產(chǎn)率”提高3～5倍。 5.優(yōu)化了紫杉醇提取和檢測(cè)的常規(guī)方法：乙酸乙酯-丙酮法超聲提取，一次浸膏三氯甲烷溶解，三氯甲烷和碳酸鉀溶液脫脂(SPE純化褪色，可選

5、項(xiàng))，樣品純度高，HPLC檢測(cè)重復(fù)性好，回收率89％以上。 6.發(fā)現(xiàn)了太行紅豆杉及細(xì)胞系的一些基本特性：天然1～2年生紅豆杉枝葉紫杉醇含量在0.01～0.02％之間，25℃時(shí)建立的細(xì)胞系繼代周期為45 d左右，生長(zhǎng)周期呈“S”曲線，生長(zhǎng)速率0.24～0.30 g·g-1·d-1(鮮重)，紫杉醇含量最高可達(dá)0.0224％。 7.建立的細(xì)胞系和培養(yǎng)技術(shù)，預(yù)計(jì)經(jīng)濟(jì)效益指標(biāo)可達(dá)細(xì)胞產(chǎn)物12.495 kg/m2/年，理論上可獲得紫