家蠶THY超家族蛋白的表達功能分析和亞細胞定位研究.pdf

1、我們從本實驗室構(gòu)建的家蠶蛹cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)了一條cDNA序列(基因登錄號為FJ602790)，該序列是由3個外顯子，2個內(nèi)含子剪接而成。序列比對后發(fā)現(xiàn)其ORF為39.bp，編碼132個氨基酸殘基。將推測的氨基酸序列進行同源性(BlastP)比對，發(fā)現(xiàn)此蛋白序列含有兩個TH.(Thymosin)保守結(jié)構(gòu)域，屬保守假定蛋白，因此將其命名為BmTHY，生物信息學預(yù)測其分子量為14.74kDa，等電點為4.83。
　　 我們利用大腸桿

2、菌表達系統(tǒng)成功表達了含有His標簽的BmTHY融合蛋白，預(yù)測分子量合計為18.4kDa，主要以可溶形式存在于上清中，用N.Sepharos.6Fas.Flow親和層析柱純化融合的目的蛋白，經(jīng)FPLC反相柱層析進一步純化，進行質(zhì)譜分析，得到該融合蛋白的分子量為18.409kDa，證實了該蛋白表達的正確性。用得到的純化融合蛋白為抗原免疫新西蘭白兔，制備該融合蛋白的多克隆抗體。ELISA檢測該抗血清(多克隆抗體)的效價可達到1:25600以上

3、。用制備的多克隆抗體進行Wester.blotting檢測發(fā)現(xiàn)，BmTHY蛋白在家蠶五齡幼蟲組織中的卵巢，頭，皮均有表達，在蛹和蛾的發(fā)育階段有表達。熒光定量PCR的結(jié)果表明，家蠶BmTH.mRNA在家蠶的各個發(fā)育時期及不同組織中廣泛存在，其中在家蠶的各個發(fā)育時期中，蛾的表達量較高，卵的表達量較低；在五齡幼蟲的頭、卵巢、中腸、馬氏管、氣管、表皮、脂肪體，絲腺等組織中BmTHY的mRNA含量依次減少。用免疫熒光的方法對家蠶的Bm5細胞進行亞