靈芝子實(shí)體多糖(綴合物)的純化、結(jié)構(gòu)鑒定、分子改性和生物活性研究.pdf

1、靈芝(Ganoderma lucidum(Curtis：Fr.)p.Karst)在中國以及東南亞國家作為中草藥應(yīng)用于治療各類疾病已有悠久的歷史，其在臨床上被應(yīng)用于治療肝炎、慢性支氣管炎、哮喘、冠心病、心絞痛、高血壓、高血脂、神經(jīng)衰弱、腫瘤等多種疾病。然而，靈芝應(yīng)用于疾病的治療很大程度上依賴于古文獻(xiàn)對其藥理作用的記載，近年來，越來越多的研究者們對靈芝的作用機(jī)理和生物活性物質(zhì)進(jìn)行了研究。多糖(綴合物)作為靈芝中一種極為重要的生理活性物質(zhì)，也

2、同時(shí)受到了越來越多的關(guān)注；由于過去分析和技術(shù)手段的落后，對多糖類物質(zhì)的研究主要集中對其單糖成分等進(jìn)行簡單的描述，很少深入地涉及對其結(jié)構(gòu)較完整的闡述，所以給靈芝多糖藥物及保健產(chǎn)品開發(fā)沒有提供更深層次的資料，同時(shí)也沒有為多糖一些生理活性機(jī)理的研究建立結(jié)構(gòu)信息方面的基礎(chǔ)。本文旨在通過對靈芝子實(shí)體多糖(綴合物)結(jié)構(gòu)較深入地分析，同時(shí)結(jié)合化學(xué)改性和生理活性的研究，為進(jìn)一步驗(yàn)證靈芝的藥理活性以及促進(jìn)靈芝相關(guān)產(chǎn)品或藥品的開發(fā)、提升靈芝產(chǎn)品或藥品的開發(fā)

3、深度和廣度提供更為深入的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 1.靈芝子實(shí)體多糖(綴合物)分離純化及理化性質(zhì)研究 119＃靈芝子實(shí)體經(jīng)醇脫脂，超濾分級，弱陰離子柱層析(DEAE-Sepharose Fast Flow)，部分組分經(jīng)Sevag法脫去游離蛋白，凝膠柱層析(Sephacryl S系列、CL-6B等)和HPLC鑒定獲得了二個(gè)均一多糖(LZ-C-1和LZ-D-1)和四個(gè)均一多糖肽LZ-B-1、LZ-C-2、LZ-C-3、LZ-D-4)和一個(gè)

4、均一多糖-蛋白復(fù)合物L(fēng)Z-D-7。用高效液相色譜法、苯酚-硫酸法和BCA法對其分子量、總糖含量和蛋白(肽)含量進(jìn)行鑒定，結(jié)果如下：LZ-B-1、LZ-C-3、、LZ-D-4為白色粉末狀樣品，LZ-D-1、LZ-C-1、LZ-C-2為白色絮狀樣品，LZ-D-7為白色纖維狀樣品；LZ-B-1、LZ-C-1、LZ-C-2、LZ-C-3和LZ-D-1均易溶于水、二甲基亞砜；LZ-D-4、LZ-D-7可溶于水、二甲亞砜，且LZ-D-7的溶解度比L

5、Z-D-4更小。 2.靈芝多糖(綴合物)的結(jié)構(gòu)研究 2.1 靈芝多糖(綴合物)多糖亞基的結(jié)構(gòu)研究 2.1.1 靈芝多糖肽LZ-B-1多糖亞基的結(jié)構(gòu)研究 多糖肽LZ-B-1多糖亞基的一級重復(fù)結(jié)構(gòu)單元主要由1，6-disubstituted-Galp，1，2，6-trisubstituted-Galp，1-substituted-Fucp，1，3-disubstituted-Glcp，1，4，6-tris

6、ubstituted-Glcp，1-substituted-Glcp等單糖殘基組成，其摩爾比大約為1：4：1：0.5：0.5：0.5，同時(shí)還有少量1，6-disubsituted-Glcp，1-substituted-Galp，1-substituted-Manp及1，3，6-trisubstituted-Manp等。 2.1.2 靈芝多糖LZ-C-1的結(jié)構(gòu)研究 多糖LZ-C-1一級結(jié)構(gòu)主要由1-substituted-

7、Fucp，1，2，6-trisubstituted-Galp，1-substituted-Glcp，1，6-disubstituted-Galp，1，3-disubstituted-Glcp和1，4，6-trisubstituted-Glcp等單糖殘基組成，其摩爾比約為1:1：2：4：2：2，并且含有少量1，6-disubstituted-Manp和其它類型的單糖殘基。 2.1.3 靈芝多糖LZ-D-1的結(jié)構(gòu)研究 多糖L

8、Z-D-1一級結(jié)構(gòu)主要由1-substituted-Fucp，1，2，6-trisubstituted-Galp，1，6-disubstituted-Galp和1，6-disubstituted-Glcp等單糖殘基組成，其摩爾比約為0.96：1.00：4.01：0.64，并且含有少量1，6-disubstituted-Manp，1，3-disubstituted-Glcp和其它類型的單糖殘基；其主要結(jié)構(gòu)中可能存在以下重復(fù)單元：進(jìn)一步通過

9、分析可知?dú)埢?，6-disubstituted-Glcp可能與1，2，6-trisubstituted-Galp相連，同時(shí)可能每重復(fù)兩次以上重復(fù)單元連接一個(gè)1，6-disubstituted-Glcp。 2.1.4 靈芝多糖肽LZ-D-4多糖亞基的結(jié)構(gòu)研究 經(jīng)過分析，推斷出多糖肽LZ-D-4的多糖亞基的主要結(jié)構(gòu)。 2.2 靈芝多糖(綴合物)糖亞基與蛋白(肽)亞基之間連接型式研究 對LZ-B-1、LZ-D-

10、4和LZ-D-7的多糖與蛋白質(zhì)(肽)連接構(gòu)型進(jìn)行分析表明三種多糖一蛋白質(zhì)(肽)復(fù)合物均可能為通過天冬氨基建立的N-連接構(gòu)型。 3.靈芝多糖肽LZ-D-4分子改性研究 經(jīng)過超濾、凝膠過濾所得的靈芝多糖肽均一體LZ-D-4，分子量為1.56×104Da，但其水溶性不是很理想；通過以氯磺酸-吡啶鹽(CSA： Pyr=1：6)為酯化試劑制得了一種LZ-D-4的硫酸酯，命名為LZ-D-9。LZ-D-9的得率為73％，分子量為1.3

11、0×104Da，硫含量為2.30％，取代度為0.12。 LZ-D-4在DMSO中以吡啶、乙酸酐為酯化試劑制得了一種乙酰酯多糖LZ-D-10，其得率為90％分子量為1.47×104Da，乙?；繛?％取代度為0.85。提出了使用1HNMR積分面積推導(dǎo)乙酰基含量和取代度的方法，并建立了糖殘基為六碳糖的計(jì)算方程： 1)乙?；康挠?jì)算 乙酰基％=43×Aa/43×Aa+483×(A1+A2+……An)×100％

12、 2)乙酰基的取代度的計(jì)算： 取代度(D．S．)指的是乙酰基團(tuán)在每個(gè)糖環(huán)的數(shù)量，計(jì)算公式如下：D．S．=Aa/3×(A1+A2+……An) 4. 生物活性的研究 經(jīng)過分離純化所得各組分進(jìn)行了小鼠脾淋巴細(xì)胞(BALB/c)、小鼠淋巴癌細(xì)胞(L1210)和大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞來源的未成熟神經(jīng)元細(xì)胞(PC12)活性研究。 4.1 靈芝子實(shí)體多糖(綴合物)及其衍生物的對小鼠脾淋巴細(xì)胞刺激作用研究發(fā)現(xiàn)超濾后組分GL

13、PD對小鼠脾淋巴細(xì)胞的刺激作用明顯優(yōu)于總提取物GLP及另外兩個(gè)組分GLPB和GLPC，并且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，當(dāng)樣品濃度為500μg/mL時(shí)，其刺激增殖率達(dá)到197％(10μg/mL陽性對照PHA刺激增殖率達(dá)到284％)，因此，超濾對獲得刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞作用提高的組分起到了一定的效果；經(jīng)DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱層析所得的各組分對刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖作用試驗(yàn)結(jié)果表明樣品GLPBW、GLPBS2、

14、GLPDS1和GLPDS2對小鼠脾淋巴細(xì)胞的刺激作用明顯高于其它供試樣品，其樣品的最高刺激率分別為273.05％、280.10％、282.34％和260.04％，均接近于陽性對照(PHA)，且前面三個(gè)樣品具有濃度依賴性，其它樣品對小鼠脾淋巴細(xì)胞刺激的增殖作用均明顯小于陽性對照但具有一定的刺激作用，各樣品對淋巴細(xì)胞的刺激作用存在著一定濃度依賴性；研究了組分GLPB、GLPC、GLPD及其經(jīng)離子層析后所得各組分之間的活性比較，發(fā)現(xiàn)經(jīng)離子層析

15、后所得組分GLPBW、GLPBS2、GLPCS1、GLPCS2、GLPDS1、GLPDS2對小鼠脾淋巴細(xì)胞的刺激作用明顯地優(yōu)于其上一級組分，從生物活性上分析達(dá)到了一定的分離效果；研究了經(jīng)凝膠層析所得各均一多糖(綴合物)對小鼠脾淋巴細(xì)胞的刺激作用，發(fā)現(xiàn)樣品LZ-D-7具有很強(qiáng)的刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞的作用，當(dāng)樣品濃度為50μg/mL時(shí)其對小鼠脾淋巴細(xì)胞的刺激增殖率為283.58％，與陽性對照相當(dāng)，當(dāng)樣品濃度為200μg/mL時(shí)其刺激率超過陽性

16、對照，當(dāng)樣品濃度為500μg/mL達(dá)到333.15％，同時(shí)呈現(xiàn)了一定的濃度依賴性，樣品LZ-B-1、LZ-D-1也表現(xiàn)出了一定的刺激作用，但效果不如LZ-D-7，其余樣品對小鼠脾淋巴細(xì)胞有輕微的刺激作用；同時(shí)研究了LZ-D-4及其硫酸化和乙?；苌飳π∈笃⒘馨图?xì)胞的刺激作用，發(fā)現(xiàn)硫酸化樣品LZ-D-9對小鼠脾淋巴細(xì)胞的刺激作用沒有明顯變化，但乙?；瘶悠稬Z-D-10對小鼠脾淋巴細(xì)胞的刺激作用有所增加，說明了乙酰化從一定程度上能提高多糖

17、的免疫活性。 4.2 靈芝子實(shí)體多糖(綴合物)及其衍生物的對L1210細(xì)胞毒毒性研究 實(shí)驗(yàn)表明大部分組分對L1210均沒有體外抑制作用，只有樣品GLP、GLPB、LZ-D-4及硫酸化樣品LZ-D-9具有輕微的抑制腫瘤作用(細(xì)胞毒毒性)。4.3 靈芝子實(shí)體多糖(綴合物)及其衍生物對PC12細(xì)胞的研究 結(jié)果表明樣品GLP、GLPB、GLPC、GLPD、GLPBS1、GLPCS1、GLPCS2、GLPDS1對經(jīng)H2O2