有機(jī)磷水解酶基因OPD轉(zhuǎn)化番茄、黃瓜降解農(nóng)藥殘留的研究.pdf

1、化學(xué)農(nóng)藥給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)，由于施用不當(dāng)或?yàn)E用農(nóng)藥也給環(huán)境造成多種污染，其中使用量最大、毒性較高的有機(jī)磷類殺蟲劑和除草劑尤其如此?；谶@種現(xiàn)狀，本研究試圖利用微生物源有機(jī)磷農(nóng)藥水解酶OPH的編碼基因OPD，構(gòu)建組成性表達(dá)載體和果實(shí)特異性表達(dá)載體，分別遺傳轉(zhuǎn)化番茄和黃瓜，通過基因工程提高它們降解有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的能力，以減少番茄和黃瓜中農(nóng)藥殘留給人們的健康造成不良影響。獲得如下研究結(jié)果。
　?。?）表達(dá)載體構(gòu)建與番茄瞬時(shí)

2、表達(dá)分析
　　構(gòu)建了CaMV 35S驅(qū)動(dòng)OPD的表達(dá)載體pSOP?？寺》压麑?shí)特異性啟動(dòng)子E8，構(gòu)建了E8驅(qū)動(dòng)OPD的表達(dá)載體pSE8OP。在番茄果實(shí)中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)分析，證明OPD基因能夠在番茄果實(shí)中獲得表達(dá)。利用全波長掃描和熒光檢測，亦證明番茄瞬時(shí)表達(dá)的OPH具有水解有機(jī)磷農(nóng)藥蠅毒磷的活性，最大酶活約11.59U/mg可溶性蛋白。建立的番茄瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，可以在1周左右快速有效地檢測基因表達(dá)能力。
　　（2）轉(zhuǎn)基因黃瓜表達(dá)有

3、機(jī)磷農(nóng)藥水解酶分析
　　優(yōu)選出津研4號(hào)黃瓜(Cucumis sativus L.Jinyan 4)的再生和轉(zhuǎn)化條件。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)，把35S-OPD表達(dá)元件轉(zhuǎn)化到津研4號(hào)黃瓜中，篩選出9株Kan抗性轉(zhuǎn)化苗，檢測其中3株GUS陽性轉(zhuǎn)化苗的葉片對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥蠅毒磷的降解能力，其中c-2株系的活性最高，酶活達(dá)到7.82μmol/mg·min，c-1株系的酶活為5.6μmol/mg·min，c-3株系的酶活為3.8μmol/mg·min。首

4、次通過表達(dá)有機(jī)磷農(nóng)藥水解酶OPH，提高了黃瓜降解有機(jī)磷農(nóng)藥的能力。
　?。?）轉(zhuǎn)基因番茄表達(dá)有機(jī)磷農(nóng)藥水解酶分析
　　優(yōu)選出Micro-Tom番茄(Solanum lycopersicum cv.Micro-Tom)的再生和轉(zhuǎn)化條件。分別把35S-OPD和E8-OPD表達(dá)元件轉(zhuǎn)化到Micro-Tom番茄中。通過GUS染色、PCR檢測和Southern blotting分析，證明OPD基因已整合進(jìn)轉(zhuǎn)基因植株基因組中，具有1個(gè)拷

5、貝。通過RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，E8驅(qū)動(dòng)OPD基因在番茄果實(shí)中獲得表達(dá)，但在葉片中未能檢測到OPD基因的表達(dá)。通過檢測不同時(shí)期果實(shí)中有機(jī)磷農(nóng)藥水解酶的活性，發(fā)現(xiàn)番茄在幼果期就表現(xiàn)出水解蠅毒磷活性，酶活達(dá)到43.8±4.5μmol/mg·min；青果期酶活是非轉(zhuǎn)基因番茄的3倍以上，達(dá)到46.6±5.7μmol/mg·min；破色期酶活是非轉(zhuǎn)基因番茄的12倍以上，達(dá)到101.0±4.3μmol/mg·min。轉(zhuǎn)基因番茄OPH酶降解蠅毒磷的ma

6、xV為2.73μmol/mg·min，mK為4.04μmol/L。比較轉(zhuǎn)基因番茄和非轉(zhuǎn)基因番茄對(duì)蠅毒磷的降解能力，結(jié)果表明非轉(zhuǎn)基因番茄對(duì)蠅毒磷有很低的酶活性，轉(zhuǎn)基因番茄通過表達(dá)有機(jī)磷農(nóng)藥水解酶OPH提高了對(duì)蠅毒磷的降解能力。首次通過在番茄果實(shí)中特異性表達(dá)OPH，提高了果實(shí)降解有機(jī)磷農(nóng)藥的能力，同時(shí)也不足以降低葉子上噴施農(nóng)藥的藥效。
　?。?）重組OPH酶性質(zhì)分析
　　轉(zhuǎn)基因番茄重組表達(dá)OPH的最適反應(yīng)溫度為30℃，最適pH為

7、9.0，溫度穩(wěn)定性高，70℃時(shí)仍保留54％的酶活；在Co2+存在時(shí)酶活最高，是天然Zn2+條件下酶活的2倍以上；易受到螯合劑EDTA和還原劑SDS、β-ME、TritonX-100和DTT的抑制；果實(shí)特異性表達(dá)OPH使番茄降解對(duì)硫磷的能力提高了2倍以上，降解毒死蜱能力提高了3-7倍，對(duì)樂果降解影響不明顯。HPLC分析20μg/ml對(duì)硫磷或毒死蜱中浸泡24h后番茄的農(nóng)藥殘留，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因番茄葉子和果實(shí)中的對(duì)硫磷殘留比非轉(zhuǎn)基因番茄的分別少

8、8.1％和40.0％，轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)中毒死蜱殘留比非轉(zhuǎn)基因番茄的少40.6％，轉(zhuǎn)基因番茄能顯著提高有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的降解能力，并且具有果實(shí)特異性。重組OPH降解對(duì)硫磷的maxV為1.17μmol/mg·min，mK為11.15μmol/L；降解毒死蜱的maxV為8.80μmol/mg·min，mK為5.91μmol/L。表現(xiàn)出與微生物源OPH不同的特征，可能與OPH翻譯后修飾和定位有關(guān)。OPH翻譯后有8個(gè)絲氨酸、6個(gè)蘇氨酸和2個(gè)酪氨酸分別

9、被磷酸化。這三種氨基酸往往是酶的活性中心，其磷酸化修飾會(huì)從結(jié)構(gòu)到功能上影響OPH的活性和代謝模式。
　　（5）OPH、GUS和NptII潛在致敏性的生物信息學(xué)評(píng)估
　　首次按照FAO/WHO決策方案和Codex指標(biāo)，使用3大過敏原預(yù)測網(wǎng)站的現(xiàn)存數(shù)據(jù)和預(yù)測算法，對(duì)OPH、GUS和NptII的潛在食品致敏性進(jìn)行評(píng)估。在線Blast或Fasta比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，OPH、GUS和NptII的全序列匹配性和連續(xù)80aa匹配性皆不存在致敏性

10、可能。連續(xù)6aa匹配中，OPH有2個(gè)片段與大豆、小麥和橡膠樹前纖維蛋白，以及德國蟑螂過敏原相關(guān)蛋白存在序列一致；GUS有1個(gè)片段與埃及伊蚊唾液腺過敏原存在序列一致；NptII有1個(gè)片段與搖蚊血紅蛋白過敏原存在序列一致，但匹配的6aa序列皆不在各蛋白抗原性決定部位。初步說明用于轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)的OPH、GUS和NptII不具有潛在的致敏性風(fēng)險(xiǎn)。
　?。?）降解有機(jī)磷樂果菌株的分離與鑒定
　　經(jīng)梯度富集和馴化，從貴陽花溪的農(nóng)田土壤

11、中，分離、篩選出兩株具有降解有機(jī)磷農(nóng)藥樂果的真菌菌株F1和F2。比較分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)1菌株降解樂果能力顯著比F2菌株高，但是耐受性不如F2菌株。進(jìn)一步分析三種碳源對(duì)F1菌株降解能力的影響，發(fā)現(xiàn)F1菌株在BM培養(yǎng)液中，能夠快速降解100mg/L樂果，但是補(bǔ)充的碳源會(huì)延遲菌株對(duì)樂果的降解。經(jīng)形態(tài)觀察和rDNAITS序列分析，證明F1菌株屬于鐮刀菌屬（Fusarium sp.）。首次從貴州農(nóng)田土壤中篩選出降解樂果的鐮刀菌Fusarium sp.F