周期蛋白依賴的激酶10、磷脂酶C伽馬1及熱休克蛋白90在昆蟲蛻皮激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的功能研究.pdf

1、研究背景：
　　由于昆蟲個(gè)體發(fā)育階段明顯分為蛻皮和變態(tài)，所以科學(xué)家將其作為研究多細(xì)胞生物發(fā)育轉(zhuǎn)變分子機(jī)理的理想模式系統(tǒng)。自從StefanKope(c)對(duì)舞毒蛾變態(tài)發(fā)育的研究開(kāi)始(Kope(c)，1926)，近一個(gè)世紀(jì)以來(lái)，科學(xué)家一直對(duì)昆蟲內(nèi)分泌的研究保持著濃厚的興趣。由于在舞毒蛾中的開(kāi)拓性研究，導(dǎo)致了包括神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞(Kope(c)，1922)等一系列新穎概念的提出，從而大大促進(jìn)了現(xiàn)代內(nèi)分泌學(xué)的發(fā)展。近年來(lái)，由于分子生物學(xué)等各項(xiàng)

2、技術(shù)的快速發(fā)展，科學(xué)家對(duì)昆蟲蛻皮和變態(tài)這兩個(gè)重要發(fā)育轉(zhuǎn)變的分子機(jī)理有了更加深刻的認(rèn)識(shí)。研究發(fā)現(xiàn)，這些發(fā)育轉(zhuǎn)變受到昆蟲內(nèi)分泌系統(tǒng)嚴(yán)格的調(diào)控，而控制蛻皮和變態(tài)的激素主要是蛻皮激素(20-hydroxyecdysone，20E)和保幼激素(juvenilehormone，JH)。
　　本領(lǐng)域存在的科學(xué)問(wèn)題和研究意義
　　在JH存在下，20E誘導(dǎo)昆蟲在幼蟲期的多次蛻皮;而當(dāng)JH滴度下降時(shí)，20E促進(jìn)昆蟲從幼蟲到蛹的變態(tài)發(fā)育。因此，2

3、0E和JH信號(hào)通路通過(guò)復(fù)雜的相互作用共同調(diào)控昆蟲的發(fā)育，但是其分子機(jī)理還有待于進(jìn)一步的研究。在20E信號(hào)通路中，20E誘導(dǎo)核受體EcR/USP的形成及共激活子的募集，從而形成具有DNA結(jié)合活性的轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，最終調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。越來(lái)越多的研究表明，除了經(jīng)典的核受體途徑，在20E信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中還存在一種細(xì)胞膜介導(dǎo)的非基因組途徑。但是，其機(jī)制還沒(méi)有深入研究。在JH通路中，由于其受體Met的鑒定，JH信號(hào)通路的研究蔚然成風(fēng)，但是關(guān)于20E和JH信

4、號(hào)通路之間相互作用的機(jī)理還并不清楚。
　　人類周期蛋白依賴的激酶10(cyclin-dependentkinase10，CDK10)可以與Hsp90發(fā)生相互作用，但是機(jī)理并不清楚。已知Hsp90參與調(diào)控EcR的DNA活性，并調(diào)節(jié)20E信號(hào)通路。另外，胰島素可以有效誘導(dǎo)CDK10的快速磷酸化。這些現(xiàn)象暗示，CDK10可能通過(guò)與Hsp90的相互作用參與20E通路。同時(shí)，我們有必要探索20E能否誘導(dǎo)CDK10的快速磷酸化參與20E激活的

5、非基因組途徑。在家蠶和果蠅中的研究表明，20E可以通過(guò)細(xì)胞膜上的G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein-coupledreceptor，GPCR)誘導(dǎo)鈣離子水平上調(diào)。果蠅中USP的磷酸化依賴于20E對(duì)PKC的激活。然而，20E誘導(dǎo)的鈣信號(hào)與PKC激活的USP磷酸化之間的聯(lián)系還沒(méi)有報(bào)道。事實(shí)上，一種磷脂酶C(phospholipaseCgamma1，PLCG1)可以承接GPCR信號(hào)并通過(guò)上調(diào)鈣信號(hào)而激活PKC。所以，20E誘導(dǎo)的細(xì)胞膜信號(hào)與核

6、受體信號(hào)之間的聯(lián)系是否依賴于PLCG1則需要深入的探討。在20E信號(hào)通路中，Hsp90和Hsc70(Hsp70同源蛋白)通過(guò)與果蠅EcR相互作用調(diào)節(jié)受體的DNA結(jié)合活性，但是當(dāng)受體裝配成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體后，熱休克蛋白則解離下來(lái)而并不出現(xiàn)在啟動(dòng)子區(qū)域的復(fù)合體中。然而也有文章報(bào)道，Hsp90可以調(diào)控鹽皮質(zhì)激素受體結(jié)合于啟動(dòng)子的不同位置，這暗示它可能參與到轉(zhuǎn)錄復(fù)合體中。另外Hsc70對(duì)于受體的循環(huán)和降解也起著至關(guān)重要的作用。因此，Hsp90和Hsc

7、70是否參與棉鈴蟲20E信號(hào)轉(zhuǎn)錄復(fù)合體并調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，需要更進(jìn)一步的研究。
　　鑒于20E和JH能通過(guò)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)精密有效地控制昆蟲發(fā)育，所以闡明20E和JH信號(hào)通路不僅能為害蟲防治提供策略，也能夠?yàn)檠芯咳祟悆?nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)節(jié)機(jī)理提供參考，最終服務(wù)于人類健康。
　　研究方法與取得成果：
　　1.20E通過(guò)誘導(dǎo)蛋白激酶CDK10的快速磷酸化調(diào)節(jié)蛻皮激素核受體在啟動(dòng)子上的裝配
　　利用RNA干擾技術(shù)下調(diào)幼蟲和表皮細(xì)胞系中

8、的CDK10阻礙了幼蟲發(fā)育并抑制20E可誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄。20E誘導(dǎo)CDK10的快速磷酸化，但是G蛋白偶聯(lián)受體、磷脂酶C、鈣離子通道等蛋白的抑制劑都能抑制此磷酸化。磷酸化的CDK10促進(jìn)其與熱休克蛋白(heatshockproteins，Hsps)Hsc70和Hsp90的相互作用，隨后有助于更多的Hsc70和Hsp90與蛻皮激素受體EcRB1的相互作用，并最終促進(jìn)Hsps-EcRB1復(fù)合體結(jié)合到20E應(yīng)答元件上調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。下調(diào)CDK10

9、可以抑制Hsps-EcRB1復(fù)合體在HR3啟動(dòng)子上的形成。以上結(jié)果說(shuō)明，20E通過(guò)非基因組途徑誘導(dǎo)CDK10磷酸化，并最終調(diào)控細(xì)胞核中的基因轉(zhuǎn)錄。
　　2.PLCG1將ErGPCR介導(dǎo)的20E膜信號(hào)與核受體信號(hào)有效連接
　　通過(guò)RNA干擾沉默PLCG1后，20E誘導(dǎo)的昆蟲化蛹被顯著抑制，并導(dǎo)致幼蟲死亡和化蛹缺陷，同時(shí)20E可誘導(dǎo)基因的表達(dá)被下調(diào)。20E誘導(dǎo)PLCG1發(fā)生酪氨酸磷酸化并向細(xì)胞膜遷移。Src激酶家族抑制劑PP2、

10、沉默ErGPCR和Gαq都能抑制PLCG1的酪氨酸磷酸化。PLCG1參與調(diào)節(jié)20E誘導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流。抑制GPCR、PLC、IP3受體(1，4，5-trisphosphatereceptor)或鈣離子通道均有效抑制20E誘導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流和蛻皮激素應(yīng)答元件EcRE激活的轉(zhuǎn)錄。通過(guò)PLCG1和鈣離子信號(hào)途徑，20E調(diào)控了PKC對(duì)USP1第21位絲氨酸(Ser21)磷酸化的催化，而這決定了USP1與EcRE的結(jié)合活性。這些結(jié)果說(shuō)明，20E通

11、過(guò)ErGPCR和Src激活PLCG1，從而誘導(dǎo)Ca2+內(nèi)流和USP1的PKC磷酸化，最后調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。
　　3.熱休克蛋白Hsp90通過(guò)磷酸化狀態(tài)的轉(zhuǎn)換和蛋白質(zhì)相互作用的改變調(diào)節(jié)20E和JH信號(hào)通路的相互作用
　　激素誘導(dǎo)和免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示，20E和JHⅢ以及JH類似物methoprene都能誘導(dǎo)Hsp90表達(dá)上調(diào)和向細(xì)胞核部分轉(zhuǎn)移。qRT-PCR分析說(shuō)明，干擾Hsp90后有效抑制了20E和JH信號(hào)通路中相關(guān)基因的表達(dá)。

12、蛋白質(zhì)免疫共沉淀結(jié)果顯示，20E誘導(dǎo)Hsp90與USP1相互作用，而JH誘導(dǎo)Hsp90與Met1相互作用，20E和JH能互相拮抗各自誘導(dǎo)的相互作用。PKC磷酸化抗體分析說(shuō)明，JH能誘導(dǎo)Hsp90發(fā)生PKC催化的磷酸化，而20E拮抗JH誘導(dǎo)的Hsp90磷酸化。因此，20E和JH通過(guò)調(diào)控Hsp90磷酸化狀態(tài)的改變實(shí)現(xiàn)相互作用。
　　所取得成果的創(chuàng)新點(diǎn)和意義：
　　本文的創(chuàng)新點(diǎn)主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面:(1)首次證明了Hsp90在J

13、H信號(hào)通路中的功能，及其在20E和JH信號(hào)相互作用中的功能;(2)首次發(fā)現(xiàn)20E可以通過(guò)ErGPCR、PLCG1和鈣信號(hào)誘導(dǎo)CDK10快速磷酸化，以及CDK10磷酸化對(duì)Hsp90和Hsc70介導(dǎo)的核受體裝配的調(diào)節(jié)功能;(3)首次證明Hsp90和Hsc70可以定位于結(jié)合有蛻皮激素啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄復(fù)合體中;(4)首次發(fā)現(xiàn)PLCG1通過(guò)激活PKC而磷酸化USP1，且這一過(guò)程依賴于ErGPCR和鈣信號(hào)上調(diào);(5)鑒定了棉鈴蟲USP1的PKC催化的磷