果蠅細(xì)胞凋亡抑制因子類(lèi)似蛋白和MA3蛋白結(jié)構(gòu)域異構(gòu)酶在擬南芥細(xì)胞死亡中的功能分析.pdf

1、程序化細(xì)胞死亡(programmed cell death，PCD)通過(guò)精確調(diào)控細(xì)胞死亡從而在各種生物的正常生長(zhǎng)發(fā)育、組織平衡保持和逆境反應(yīng)中起重要作用。在植物中，PCD的作用早已得到確認(rèn)，而且最近研究證明一些蛋白參與PCD的調(diào)控。但是，植物中PCD的分子和遺傳機(jī)制很大程度上不是很清楚。在我的博士論文研究中，通過(guò)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，我鑒定了擬南芥中兩個(gè)與果蠅細(xì)胞凋亡抑制子相似的新蛋白AtDALl和AtDAL2，并利用T-DNA插入突變體對(duì)

2、AtDAL1和AtDAL2在病菌和腐馬霉素誘導(dǎo)的PCD中的作用進(jìn)行了功能分析。同時(shí)，我還研究了一類(lèi)MA3結(jié)構(gòu)域蛋白異構(gòu)酶與PCD的關(guān)系。
　　 DIAP1是果蠅的一個(gè)細(xì)胞凋亡抑制子，不僅調(diào)控細(xì)胞死亡，而且也參與細(xì)胞分化、蛋白翻轉(zhuǎn)和細(xì)胞循環(huán)進(jìn)程等過(guò)程的信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)控。以DIAP1蛋白序列進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，鑒定到兩個(gè)類(lèi)似蛋白，并命名為DAL1和DAL2(DIAP1類(lèi)似蛋白1和2)。DAL1和DAL2蛋白與DIAP1具有一定的相似性，在C

3、-末端含有一個(gè)典型的RING結(jié)構(gòu)域。RT-PCR分析表明，在接種Pseudomonas syrinage pv.tomato(Pst)DC3000毒性和無(wú)毒菌株后，野生型擬南芥植株中DAL1和DAL2基因表達(dá)上調(diào)；而且PCD誘導(dǎo)因子腐馬霉素FB1處理后也誘導(dǎo)了DAL1和DAL2的表達(dá)。為了研究DAL1和DAL2在PCD中的作用，篩選獲得了DAL1和DAL2基因的T-DNA插入突變體，分別命名為dall-1、dall-2、dal2-1和d

4、al2-2。RT-PCR分析證明，在T-DNA插入突變體植株中不能檢測(cè)到DAL1和DAL2基因的轉(zhuǎn)錄本，證明篩選獲得的dall-1、dall-2、dal2-1和dal2-2分別是DAL1和DAL2基因的敲除突變體。接種Pst DC3000毒性菌株后，dall和dal2突變體植株的病害表型與野生型植株相似，表明DAL1和DAL2基因喪失功能后并不改變對(duì)毒性病菌的病害表型。當(dāng)接種無(wú)毒菌株P(guān)st DC3000-AvrRpml時(shí)，dall和da

5、l2突變體植株上病害表型明顯比野生型植株要嚴(yán)重得多。Pst DC3000毒性和無(wú)毒菌株時(shí)都能誘導(dǎo)PR-I基因的表達(dá)，但是，dall和dal2突變體植株中PR-1基因表達(dá)水平與野生型植株沒(méi)有顯著差別。接種Pst DC3000無(wú)毒菌株后，在dall和dal2突變體植株中觀察到明顯的超氧陰離子積累和細(xì)胞死亡。FB1注射后，與野生型植株相比，dall-1、dall-2、dal2-1和dal2-2植株表現(xiàn)出加速細(xì)胞死亡，并有高水平的活性氧積累、自

6、發(fā)熒光和胼胝質(zhì)沉積。dall和dal2突變體植株對(duì)早疫病(Alternaria brassicicola)表現(xiàn)出增加感病性，但不改變對(duì)灰霉病(Botrytis cinerea)的抗性水平。但是，在酵母中過(guò)量表達(dá)DAL1和DAL2是擬南芥PCD的新的抑制子。
　　 在動(dòng)物系統(tǒng)中，拓?fù)洚悩?gòu)酶基因的異常表達(dá)通常與細(xì)胞凋亡有關(guān)，如拓?fù)洚悩?gòu)酶與凋亡性細(xì)胞死亡密切相關(guān)。本研究中，我從擬南芥中鑒定到一個(gè)含有MA3結(jié)構(gòu)域的拓?fù)洚悩?gòu)酶亞群，命名為

7、TOP1、TOP2、TOP3和TOP4。RT-PCR分析表明，接種Pst DC3000毒性和無(wú)毒菌株后擬南芥植株中TOP1和TOP2基因表達(dá)上調(diào)。為了研究這類(lèi)MA3結(jié)構(gòu)域拓?fù)洚悩?gòu)酶基因的功能，篩選并鑒定獲得TOP1、TOP2、TOP3和TOP4基因的T-DNA插入突變體，分別為topl、top2、top3和top4； RT-PCR分析證明這些T-DNA插入突變體植株中檢測(cè)不到其基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄本。接種Pst DC3000毒性菌株后top突變

8、體的病害水平植株比野生型植株要低，但是接種Pst DC3000無(wú)毒菌株后top突變體植株表現(xiàn)出更高水平的病害癥狀。接種壞死性真菌后，top3突變體植株的病害表型與野生型相似，top4突變體植株的病害表型下降，而top1和top2突變體植株則表現(xiàn)出更加嚴(yán)重的病害表型。接種Pst DC3000無(wú)毒菌株后，top1、top2和top3突變體植株葉片的維管束和非維管束組織中觀察到明顯的自發(fā)性熒光和胼胝質(zhì)沉積，而野生型植株葉片中只限于維管束中。t