蘋(píng)果鈣反向轉(zhuǎn)運(yùn)體基因的克隆、表達(dá)特性及其功能分析研究.pdf

1、Ca2+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)體是一類(lèi)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是Ca2+重要外向轉(zhuǎn)運(yùn)器，在植物的營(yíng)養(yǎng)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著非常重要的作用。蘋(píng)果是我國(guó)的重要果樹(shù)，鈣對(duì)蘋(píng)果生長(zhǎng)、果實(shí)品質(zhì)、貯運(yùn)性等方面具有重要的影響。蘋(píng)果果實(shí)缺鈣可導(dǎo)致苦痘病、水心病等成熟期和貯藏期間生理性病害，給我國(guó)的蘋(píng)果生產(chǎn)造成巨大損失。
　　 本文從‘長(zhǎng)富6號(hào)’蘋(píng)果中克隆了Ca2+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)體基因-MdCAX1，比較了該基因與其它物種該基因的同源性，分析了該基因的結(jié)構(gòu)；克隆了該基因

2、的啟動(dòng)子序列，分析了啟動(dòng)子序列的調(diào)控元件的結(jié)合位點(diǎn)；研究了該基因的時(shí)空表達(dá)以及鈣處理?xiàng)l件下的表達(dá)特性；借助于綠色熒光蛋白，對(duì)該基因基因的亞細(xì)胞定位進(jìn)行了研究；構(gòu)建酵母表達(dá)載體，運(yùn)用酵母鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷體(K667)，對(duì)該基因的功能進(jìn)行了研究；構(gòu)建植物雙元表達(dá)載體，農(nóng)桿菌介導(dǎo)該載體轉(zhuǎn)化煙草，對(duì)該基因的功能進(jìn)行了研究；構(gòu)建果實(shí)特異啟動(dòng)子2A11控制的該基因的植物雙元表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化番茄，為今后運(yùn)用基因工程提高蘋(píng)果品質(zhì)，提供了理論依據(jù)。主要研究結(jié)

3、果如下：
　　 1、以擬南芥CAX1基因的序列為源序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的蘋(píng)果EST中進(jìn)行同源搜索，獲得100條同源序列，用DNASTAR軟件中的SeqMan進(jìn)行電子拼接，獲得一段大小為1350bp的ORF編碼區(qū)，將其命名為：MdCAX1。根據(jù)該序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，在‘長(zhǎng)富6號(hào)’蘋(píng)果cDNA中進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果獲得一條1350bp大小的特異條帶。根據(jù)獲得的ORF編碼區(qū)，分別在其上下游設(shè)計(jì)兩對(duì)巢式PCR引物，進(jìn)行RACE，分別獲得了

4、一段大小為1168bp的和253bp的片段。去除編碼區(qū)序列，獲得126bp的5’UTR和402bp的3’UTR。將獲得的cDNA序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列在NCBI官方網(wǎng)站進(jìn)行BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與網(wǎng)上公布的CAX基因及蛋白有較高的同源性，其中與豇豆的同源性最高，核苷酸同源性為75％，氨基酸為73％。此外結(jié)構(gòu)分析表明，蘋(píng)果MdCAX1蛋白同樣具有CAX蛋白家族所共有的兩個(gè)特殊結(jié)構(gòu)：氮末端調(diào)節(jié)區(qū)(NRR)和鈣結(jié)合區(qū)（CaD）。同源進(jìn)化樹(shù)分

5、析表明：CAX蛋白家族可分為兩大類(lèi)，其中MdCAX1與同源性較高的VCAX1、CAX1和CAX3在亞分支聚為一類(lèi)。
　　 2、采用克隆MdCAX1全長(zhǎng)編碼區(qū)相同的引物，以‘長(zhǎng)富6號(hào)’蘋(píng)果的總DNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增、測(cè)序，獲得一條長(zhǎng)度為3543bp的DNA序列，使用在線(xiàn)內(nèi)合子分析軟件Genscan，結(jié)合獲得的該基因的ORF編碼區(qū)，對(duì)該序列進(jìn)行內(nèi)含子分析，該基因DNA序列有10個(gè)內(nèi)含子和11個(gè)外顯子。Southern blot

6、ting分析表明，在蘋(píng)果基因組里，MdCAX1基因可能有2-3個(gè)拷貝。根據(jù)克隆的MdCAX1基因DNA序列，在靠近5’端的外顯子區(qū)反向設(shè)計(jì)兩條巢式引物，以加了接頭的‘長(zhǎng)富6號(hào)’蘋(píng)果的總DNA的酶切產(chǎn)物為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增、測(cè)序，獲得3條片段，長(zhǎng)度分別為2362bp、888bp、573bp，經(jīng)比對(duì)發(fā)現(xiàn)該三條片段為同一序列，只是長(zhǎng)短不同。順式調(diào)控元件分析表明：該啟動(dòng)子除了具有TATA-BOX5、光誘導(dǎo)元件、生長(zhǎng)素調(diào)控元件、銅離子和氧誘導(dǎo)調(diào)

7、控元件、赤霉素調(diào)控元件、光誘導(dǎo)元件、脫水和黑暗誘導(dǎo)元件、生物鐘調(diào)控元件、水楊酸誘導(dǎo)元件、病原菌和鹽誘導(dǎo)調(diào)控元件、磷缺乏調(diào)控元件和乙烯調(diào)控元件之外，還發(fā)現(xiàn)了兩種與鈣離子密切相關(guān)的調(diào)控元件：一種是鈣離子響應(yīng)元件，另一種是鈣調(diào)素調(diào)控元件。
　　 3、以‘長(zhǎng)富6’號(hào)蘋(píng)果為材料，應(yīng)用熒光定量PCR的方法，研究了MdCAX1的時(shí)空表達(dá)規(guī)律及其對(duì)多種金屬離子的脅迫反應(yīng)，結(jié)果表明：MdCAX1基因在蘋(píng)果果實(shí)中花后8周存在一個(gè)表達(dá)高峰，經(jīng)過(guò)噴鈣處

8、理的同時(shí)期果實(shí)沒(méi)有該表達(dá)高峰；在離體浸鈣處理的果實(shí)中，經(jīng)過(guò)六小時(shí)處理后表達(dá)量也出現(xiàn)了一個(gè)高峰；在葉片中，前期的表達(dá)量較高，6月4日后表達(dá)量開(kāi)始下降；在莖、葉、花中都有較強(qiáng)的表達(dá)，尤其在是花中，表達(dá)量最高，而在果實(shí)的表達(dá)量很低；在鈣離子和錳離子的誘導(dǎo)后，表達(dá)量較水處理對(duì)照有大幅度的提高。
　　 4、構(gòu)建了MdCAX1基因亞細(xì)胞定位載體以及該基因和其短截基因的酵母表達(dá)載體，研究了該基因的亞細(xì)胞定位和該基因在K667的功能。結(jié)果表明：

9、該基因是一個(gè)定位在質(zhì)膜上的跨膜蛋白，不管是原初的MdCAX1基因還是該基因的短截片段都可以互補(bǔ)K667的轉(zhuǎn)運(yùn)鈣離子的功能。
　　 5、構(gòu)建了一種特殊的MdCAX1基因植物雙元表達(dá)載體，可以通過(guò)常規(guī)PCR擴(kuò)增，判斷外源基因插入的拷貝數(shù)。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將其轉(zhuǎn)入到煙草K326中，獲得了48棵潮霉素抗性苗，經(jīng)過(guò)GUS染色檢測(cè)后，獲得4棵GUS陽(yáng)性苗，分別命名為A、B、C、D。PCR、RT-PCR和Southern blotting檢測(cè)

10、表明：該4個(gè)株系均為陽(yáng)性。PCR擴(kuò)增檢測(cè)拷貝數(shù)表明：株系A(chǔ)、C、D均為單拷貝，而株系B為多拷貝，Southern blotting檢測(cè)拷貝數(shù)結(jié)果與PCR擴(kuò)增檢測(cè)一致。轉(zhuǎn)基因煙草的4個(gè)株系中，株系C和株系D的鈣離子含量顯著高于對(duì)照，分別比對(duì)照提高了22.9％和13.58％,株系A(chǔ)的鈣離子含量雖沒(méi)有顯著高于對(duì)照，但其含量也對(duì)照提高了12.8％，而株系B的鈣離子含量與對(duì)照相比，顯著低于對(duì)照中的鈣離子量，比對(duì)照降低了13.1％。對(duì)于錳離子含量而

11、言，4個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中，株系D顯著高于對(duì)照，比對(duì)照提高了147.5％，而其它3個(gè)株系A(chǔ)、B、C都顯著低于對(duì)照，分別為對(duì)照的75.3％、71.1％、83.7％。鎂離子含量比較發(fā)現(xiàn)，株系A(chǔ)、B、C顯著低于對(duì)照，分別為對(duì)照的86.3％、77.6％、73.4％，而株系D的含量與對(duì)照相當(dāng)，為對(duì)照的100.5％，沒(méi)有顯著差異。
　　 6、構(gòu)建了該基因的番茄果實(shí)特異啟動(dòng)子2A11控制的植物雙元表達(dá)載體p2A11::MdCAX1，將其轉(zhuǎn)入到番茄中

12、，獲得了28個(gè)潮霉素抗性苗，GUS染色檢測(cè)后，獲得了4個(gè)GUS陽(yáng)性株系，GUS陽(yáng)性率為14.3％,PCR和RT-PCR進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，該4個(gè)GUS陽(yáng)性株系皆為陽(yáng)性。轉(zhuǎn)基因番茄表型觀(guān)察表明，株系B株型矮小緊湊、腋芽分枝多，花蕾和復(fù)葉面積均比對(duì)照小，并且其開(kāi)花期顯著晚于對(duì)照，比對(duì)照遲49天，而株系C株型略低于對(duì)照，但其花蕾和復(fù)葉均比對(duì)照大。金屬元素含量的測(cè)定表明，獲得的部分轉(zhuǎn)MdCAX1基因的番茄株系顯著提高了Ca2+、Mg2+、Mn2+的