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1、本試驗(yàn)根掘兔SRY基因序列設(shè)計(jì)兩對(duì)引物作為兔雄性特異性引物;根據(jù)兔APP基因序列設(shè)計(jì)3對(duì)常染色體引物作為內(nèi)標(biāo)引物。根據(jù)這些引物組合建立了兔早期胚胎性別鑒定的雙重和巢式PCR反應(yīng)體系。針對(duì)所建立的雙重和巢式PCR體系進(jìn)行了不同擴(kuò)增條件的篩選和優(yōu)化,并對(duì)巢式PCR結(jié)果進(jìn)行了電泳法和非電泳法檢測(cè)的比較。同時(shí)將兔SRY基因序列分別與人、牛、綿羊和小鼠SRY基因進(jìn)行了同源性比較,并用本試驗(yàn)中所采用的SRY巢式引物分別對(duì)人、牛、綿羊和小鼠基因組DN
2、A及沖卵液進(jìn)行擴(kuò)增,檢測(cè)分析引物的特異性和分析胚胎性別鑒定過(guò)程中可能存在的污染因素。 用24只公兔、9只母兔的血液和肝臟組織基因組DNA樣品進(jìn)行多重和巢式PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明,多重PCR擴(kuò)增公兔基因組,可以擴(kuò)增出282bp的SRY基因片斷和173bp的APP基因片斷,母兔只能擴(kuò)增出173bp的APP基因片斷,擴(kuò)增靈敏度為100pg;巢式PCR兩輪擴(kuò)增后均進(jìn)行電泳法和非電泳法檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物,結(jié)果表明公兔基因組DNA擴(kuò)增出282bp的
3、SRY基因片段(電泳法),在紫外分析儀下管內(nèi)有明亮的熒光(非電泳法),母兔沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物也無(wú)熒光,擴(kuò)增靈敏度為10pg。多重PCR擴(kuò)增靈敏度明顯低于巢式PCR擴(kuò)增。但兩種PCR擴(kuò)增性別鑒定結(jié)果均與實(shí)際性別完全一致,準(zhǔn)確率為100﹪。 對(duì)12只母兔分別用進(jìn)口FSH+hCG(8只)和PMSG+hCG(4只)進(jìn)行超數(shù)排卵處理,F(xiàn)SH+hCG組(排卵點(diǎn)72.4±13.6,胚胎52.6±14.4)比PMSG+hCG組(排卵點(diǎn)32±6,胚胎2
4、1.8±4.2)獲得了更好的超排效果(P<0.01)。將部分胚胎移植給4只同期化處理的母兔,懷孕2只,其中一只妊娠20天流產(chǎn),另一只順利產(chǎn)下8只小兔。部分超排胚胎用BIO-RAID顯微操作儀和徒手切割法比較,結(jié)果表明,兔早期胚胎采用徒手切割法更靈活、簡(jiǎn)便,易于在生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行操作,但此方法要達(dá)到精確控制取樣細(xì)胞數(shù)量需要反復(fù)練習(xí)操作技巧。 用本試驗(yàn)建立的PCR反應(yīng)體系,對(duì)46枚超排胚胎性別鑒定結(jié)果表明,多重PCR只能對(duì)32細(xì)胞及以上
5、胚胎細(xì)胞獲得準(zhǔn)確鑒定,不能作為兔胚胎PCR性別鑒定的應(yīng)用;巢式PCR可以對(duì)8分胚(約4細(xì)胞)進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定(同一胚胎擴(kuò)增符合率100﹪),而且電泳法與非電泳法檢測(cè)結(jié)果一致。 兔SRY基因序列與其他幾種哺乳動(dòng)物(人、牛、綿羊、小鼠)同源性分析結(jié)果表明,兔SRY基因序列與牛、綿羊和小鼠SRY基因序列同源性在80﹪~82﹪之間,與人的為87﹪,且在本試驗(yàn)所設(shè)計(jì)的SRY基因引物,只對(duì)兔雄性特異,其他動(dòng)物(人、牛、綿羊、小鼠)雄性DNA及沖
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