噻蟲啉和烯唑醇?xì)埩裘庖叻治龇椒ǖ难芯?pdf

1、以噻蟲啉與巰基丙酸反應(yīng)合成了噻蟲啉半抗原，將噻蟲啉半抗原與牛血清蛋白(BSA)偶聯(lián)制備了免疫原，與卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)制備了包被抗原。經(jīng)紫外光譜分析證明人工抗原偶聯(lián)成功，計(jì)算出免疫原和包被原的結(jié)合比分別為12∶1和6∶1。免疫新西蘭大白兔制備了抗噻蟲啉多克隆抗體。當(dāng)包被抗原的濃度為4mg/L時(shí)，用間接非競爭酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)測定噻蟲啉抗體的效價(jià)為1.0×106。
　　通過對工作濃度、甲醇含量、離子強(qiáng)度、pH值的優(yōu)化

2、，確定了抗原抗體的最佳反應(yīng)條件。在最佳優(yōu)化的條件下（5％甲醇PBS溶液、Na+0.1M、pH5.5），建立了噻蟲啉間接競爭ELISA方法。ELISA的靈敏度（IC50值）為0.01mg/L，最低檢測限（IC10值）為0.47μg/L，與其他煙堿類殺蟲劑沒有明顯交叉反應(yīng)，表明建立的ELISA方法對噻蟲啉有很高的特異性。在自來水、田水、土壤、梨和番茄樣品中添加0.001-1mg/L(mg/kg)的噻蟲啉標(biāo)準(zhǔn)品，在水中的平均回收率在81.57

3、％-109.00％之間，在土壤、梨和番茄中的平均回收率在80.33％-118.53％之間，符合農(nóng)藥殘留檢測的要求。并用HPLC對所建立的方法進(jìn)行了驗(yàn)證，兩種檢測方法的檢測結(jié)果具有很高的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9863。
　　建立了噻蟲啉時(shí)間分辨熒光免疫分析方法。選擇銪離子螯合物為標(biāo)記物，在室溫下與羊抗兔抗體反應(yīng)，制備了Eu3+-羊抗兔抗體。通過對包被原濃度、抗體濃度、甲醇含量、離子強(qiáng)度和pH值等條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最優(yōu)條件為含有

4、5％甲醇、0.2MNa+、pH7.5的PBS，并在最優(yōu)條件下建立了噻蟲啉標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線為logit(B/B0)=-0.7253logC-1.9548，R2=0.9878，靈敏度IC50為0.002mg/L，最低檢測限IC10為2ng/L。與ELISA分析方法相比，TRFIA的靈敏度高出5倍。利用建立的TRFIA方法用于農(nóng)產(chǎn)品添加回收實(shí)驗(yàn)，同時(shí)利用HPLC對添加樣品進(jìn)行平行分析。TRFIA測定結(jié)果和HPLC測定的結(jié)果具有很好的相關(guān)性，

5、相關(guān)系數(shù)為R2=0.9966。說明建立的TRFIA方法能夠簡單、快速和準(zhǔn)確用于噻蟲啉的殘留分析。
　　通過對化學(xué)發(fā)光底物中緩沖液、增強(qiáng)劑中的有機(jī)溶劑、發(fā)光增強(qiáng)劑的篩選，以及對氧化劑的濃度的優(yōu)化，配制了具有良好化學(xué)發(fā)光性能的發(fā)光底物溶液。在此基礎(chǔ)上，通過對包被原濃度、抗體濃度、封閉物的選擇;甲醇含量、離子強(qiáng)度和pH值等條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定最優(yōu)條件為:包被原和抗體的濃度分別為1mg/L和5mg/L，2.5％脫脂奶粉為封閉物，最佳工作溶

6、液為含有5％的甲醇、pH5.5、0.4MNa+強(qiáng)度的磷酸鹽緩沖溶液。在最優(yōu)化的條件下，建立了噻蟲啉的標(biāo)曲線。其IC50為0.0018mg/L，最低檢測限IC10為O.092μg/L，結(jié)果表明建立的ECL-ELISA分析方法的靈敏度比噻蟲啉ELISA分析方法高出5倍，同時(shí)應(yīng)用于水樣的檢測分析，平均回收率為79.2％-88.5％,變異系數(shù)在3.71％-9.35％之間。
　　制備了噻蟲啉和氯噻啉酶標(biāo)半抗原，通過三種不同的直接ECL-EL

7、ISA反應(yīng)模式優(yōu)化了包被抗體濃度和酶標(biāo)半抗原濃度?；谥苽涞拿笜?biāo)半抗原和優(yōu)化的CLEIA發(fā)光底物，建立了噻蟲啉和氯噻啉的多殘留化學(xué)發(fā)光酶免疫分析。在番茄、甘藍(lán)、稻米樣品中進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)來評估單酶標(biāo)ECL-ELISA和多酶標(biāo)ECL-ELISA對噻蟲啉和氯噻啉的的檢測分析。單酶標(biāo)ECL-ELISA用來測定氯噻啉和噻蟲啉農(nóng)藥殘留時(shí)，平均回收率是84.4％-117％，變異系數(shù)是1.0％-7.3％;多酶標(biāo)ECL-ELISA法檢測噻蟲啉和氯噻啉農(nóng)

8、藥殘留時(shí)，平均回收率是83.7％-109％，變異系數(shù)是2.0％-5.8％.。當(dāng)噻蟲啉和氯噻啉殘留總量在20-250μg/kg之間，多酶標(biāo)ECL-ELISA能準(zhǔn)確分析不同比例(1∶4-4∶1，m/m)的噻蟲啉和氯噻啉的殘留，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明建立的ECL-ELISA對氯噻啉和噻蟲啉的檢測分析是一種非常有潛力的方法。
　　用建立的ECL-ELISA和HPLC方法同時(shí)檢測氯噻啉和噻蟲啉在番茄真實(shí)樣品中的降解趨勢。ECL-ELISA和HPLC檢

9、測結(jié)果的有很好的相關(guān)性，相關(guān)性方程為y=1.023x-0.0494，相關(guān)系數(shù)為R2=0.996。結(jié)果表明建立的ECL-ELISA能簡單、快速、準(zhǔn)確的檢測農(nóng)產(chǎn)品中殘留的噻蟲啉和氯噻啉。
　　合成了烯唑醇半抗原，采用混合酸酐法將烯唑醇半抗原與卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)制備了包被抗原;與牛血清蛋白(BSA)偶聯(lián)制備了免疫抗原用于免疫BALB/c小鼠。將骨髓瘤細(xì)胞SP2/0與免疫過的小鼠脾臟細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合制備雜交瘤細(xì)胞。通過系列篩選和亞克隆

10、，最后得到一株能穩(wěn)定分泌抗烯唑醇單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株(E8/H3)。當(dāng)包被抗原的濃度為4mg/L時(shí)，用間接非競爭酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)測定烯唑醇抗體的效價(jià)達(dá)到3.6×106。
　　通過反應(yīng)條件優(yōu)化確定了最佳檢測條件。在最優(yōu)的條件下（20％甲醇PBS溶液、Na+0.2mo1/L、pH6.5-8.5），建立了基于單克隆抗體的烯唑醇間接競爭酶聯(lián)免疫分析方法。方法的IC50值為0.05mg/L，最低檢測限IC10值為5.47

11、μg/L。單克隆抗體具有很高的特異性，除與烯效唑和己唑醇有很小的交叉反應(yīng)外(CR＜1.82％)，與其他三唑類殺菌劑沒有明顯的交叉反應(yīng)。在蒸餾水、自來水、池塘水、梨和番茄樣品中添加0.01-0.5mg/L(mg/kg)的烯唑醇標(biāo)準(zhǔn)品，在水中的平均回收率在80.00％-116.87％，在梨和番茄中的平均回收率在79.20％-111.32％，符合農(nóng)藥殘留檢測的要求。并對所建立的方法用GC-ECD法進(jìn)行了評估，兩者的測定結(jié)果具有很高的相似度，相