來自大黃魚腸道的弧菌拮抗菌的篩選、鑒定及其性能研究.pdf

1、大黃魚(Pseudosciaena crocea)屬石首魚科黃魚屬，為我國主要的海產(chǎn)經(jīng)濟魚類之一。但是近年來，隨著大黃魚網(wǎng)箱養(yǎng)殖業(yè)的蓬勃發(fā)展，各種魚病也頻繁發(fā)生，尤其是發(fā)病時間長、發(fā)病率和死亡率較高的弧菌病，給漁業(yè)生產(chǎn)造成嚴重的經(jīng)濟損失。由于傳統(tǒng)的抗生素等藥物長期使用后會造成細菌的多重抗藥性、藥物殘留以及對環(huán)境產(chǎn)生危害，因此，人們開始重視用生態(tài)方法防治魚病。益生菌是一種新興的生物防治方法，能夠改善養(yǎng)殖水體條件，促進飼料消化吸收，增強宿主

2、疾病抵抗力等，具有廣闊的應用前景。因此，本研究旨在從健康大黃魚腸道內(nèi)分離篩選出對病原性弧菌具有拮抗作用的益生菌候選菌株，在此基礎上對其進行分類學鑒定，并進一步研究這些拮抗菌的益生價值，包括抗菌譜、胞外產(chǎn)物抑菌效果、氨氮降解、殘餌降解等方面，以期為功能益生菌的應用、微生態(tài)制劑的研發(fā)以及水產(chǎn)養(yǎng)殖動物生態(tài)防病體系提供理論依據(jù)。
　　 本研究采用錳營養(yǎng)瓊脂、硫檸膽蔗瓊脂(TCBS)、伊紅美藍瓊脂(EMB)、海水瓊脂(2216E)和淡水瓊

3、脂(FWA)培養(yǎng)基從大黃魚腸道中分離、篩選出對大黃魚病原弧菌副溶血弧菌(Vpl.2164)和溶藻弧菌(Va-Y)有較強拮抗作用的拮抗菌12株，編號分別為：X77,X93,X1402-1,X1109,X1108,X83,X3517,X3914,X1107,X1506,X96,X1401-1，占大黃魚腸道內(nèi)所分離細菌中的10.4％，其中錳營養(yǎng)瓊脂選擇培養(yǎng)基上拮抗菌的比例最高，占50.0％，其次是EMB和FWA培養(yǎng)基，拮抗菌的比例均為16.7

4、％,最后是2216E和TCBS瓊脂，比例均為8.3％。通過點種法進行的體外拮抗實驗表明，對兩株病原弧菌抑制作用最強的菌株是X1402-1、X1107、X93、X77和X1108，對Vpl.2164和Va-Y的抑菌圈分別為28.5mm和8.7mm、23.3mm和21.1mm、25.8mm和6.8nun、15.6rnm和9.0mm、12.0mm和9.0mm，而抗菌譜測定結(jié)果顯示，X77能夠?qū)?1株指示菌中的18株病原菌產(chǎn)生抑制，X1402-

5、1、X93、X1108、X1107分別能夠抑制16株、14株、13株和11株病原菌的生長。因此，菌株X1402-1、X1107和X93對2株病原菌均有較強的拮抗作用，X77、X1402-1和X93的抗菌譜最廣。
　　 對12株細菌經(jīng)細菌鑒定系統(tǒng)及16SrRNA基因序列分析鑒定，確定它們的分類地位。經(jīng)VITEK-32細菌快速鑒定系統(tǒng)鑒定，X77、X93和X3914分別與枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的相似性均為99.0％

6、：而X1402-1、X1107、X1109和X1506與銅綠假單胞菌的相似性分別為99.0％、98.0％、99.0％、99.0％：菌株X1108和X3517與惡臭假單胞菌的相似性均為99.0％，選取拮抗作用最強的拮抗菌X77、X93、X3914、X1402-1和X1108，通過16SrRNA基因序列分析表明，5株拮抗菌的16S rRNA基因序列分別與枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis(FJ947049)、短小芽孢桿菌Baci

7、llus pumilus(EU880532)、地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformis(AB553280)、類產(chǎn)堿假單胞菌Pseudomonas pseudoalcaligenes(EU440977)和惡臭假單胞菌Pseudomonas putida(GU248219)的16SrRNA基因同源性最高，分別為99.0％、100.0％、99.0％、99.0％和100.0％。綜合分析實驗結(jié)果，5株拮抗菌分別被確定為：枯草芽孢桿

8、菌、短小芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、類產(chǎn)堿假單胞菌和惡臭假單胞菌。
　　 根據(jù)溶血實驗結(jié)果，參照Sugita的方法制備3株芽孢桿菌(編號為：X77、X93、X3914)的胞外產(chǎn)物以及采用平板擴散法研究了環(huán)境因子對其胞外產(chǎn)物抑制2株病原弧菌的抑菌活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，拮抗菌的胞外產(chǎn)物的抑菌活性強弱以及同一菌株對不同病原菌的抑制能力強弱隨著培養(yǎng)時間的不同而不同，胞外產(chǎn)物對pH條件有一定的耐受性，對熱敏感，不耐高溫，過高的NaCl能使其抑

9、菌活性降低，蛋白酶K和不同濃度的FeCl3均對其抑菌活性產(chǎn)生影響。
　　 通過對菌株的降解能力進行測試，采用靛酚藍分光光度法、比濁法、半微量凱氏定氮法、碘顯色法等分別對短小芽孢桿菌X93和地衣芽孢桿菌X3914的降解氨氮、殘余餌料的能力以及菌株生長量進行研究，測試其降解能力的強弱。結(jié)果表明，2株芽孢桿菌達到最大氨氮降解率的最適pH、溫度都是7.0和30℃，而在研究氨氮初始濃度對菌株降解氨氮能力的影響時，菌株X93和X3914達到

10、最大降解率時的氨氮濃度分別為50mg/L、100mg/L;菌株的接種量不同飼料的蛋白質(zhì)和淀粉的降解率也不同，且接種5％菌量的降解率均高于1％菌量的降解率，在48h,X93和X3914對飼料蛋白質(zhì)和淀粉的降解率分別為72.5％、72.8％和35.2％和52.6％，在48h以后降解率趨于穩(wěn)定，120h時的降解率分別為76.6％、80％和39.4％、60.5％。
　　 實驗研究表明，在本文篩選的12株拮抗菌中，菌株X93和X3914的