桉樹(shù)木質(zhì)素合成途徑兩個(gè)關(guān)鍵基因的克隆與功能研究.pdf

1、桉樹(shù)是世界上第二大人工造林樹(shù)種,桉樹(shù)木材亦是我國(guó)南方重要的造紙材料。木質(zhì)素是植物中具有重要生物功能的次生代謝產(chǎn)物,是世界上第二位豐富的有機(jī)物,然而,紙漿生產(chǎn)中須將桉木原料中的木質(zhì)素與用于造紙的纖維素分離,產(chǎn)生了大量的造紙廢液,嚴(yán)重污染環(huán)境,并且增加造紙成本。培育低木質(zhì)素的造紙植物新品種并推廣應(yīng)用正日益受到各國(guó)的高度重視,而通過(guò)RNAi轉(zhuǎn)基因技術(shù)是實(shí)現(xiàn)低木質(zhì)素育種的最快最優(yōu)途徑,亦是從源頭上降低植物木質(zhì)素含量的最有效辦法。因而,克隆桉樹(shù)木

2、質(zhì)素合成調(diào)控關(guān)鍵基因是對(duì)桉樹(shù)進(jìn)行木質(zhì)素基因工程改良的基礎(chǔ),具有重大意義。本論文主要研究結(jié)果如下:
　　 1.桉樹(shù)CAD和4CL基因的全長(zhǎng)克隆。以赤桉葉片和莖為材料,分別提取DNA和RNA,并將DNA與RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA作為模板,根據(jù)桉樹(shù)其它物種的CAD和4CL基因的核苷酸序列保守區(qū)域,利用專業(yè)軟件PrimerPremier5.0設(shè)計(jì)引物,通過(guò)PCR及RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出兩個(gè)基因的DNA片段和cDNA片段,將產(chǎn)物克隆至pMD

3、18-T載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株,并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。
　　 2.赤桉CAD和4CL基因的生物信息學(xué)分析。通過(guò)生物信息學(xué)軟件Vector NTI9.0對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析:CAD全長(zhǎng)基因組序列為2304 bp,cDNA長(zhǎng)1102 bp,含有一個(gè)1068 bp的編碼框,編碼356個(gè)氨基酸殘基；4CL全長(zhǎng)基因組序列為5481 bp,cDNA序列1670 bp,含有一個(gè)1632 bp的編碼框,編碼544個(gè)氨基酸殘基。通過(guò)GenBank

4、上的序列比對(duì),結(jié)果表明該序列與其它物種的CAD和4CL基因的一致性達(dá)到97％以上,可確認(rèn)此序列是赤桉的CAD和4CL基因的全長(zhǎng)序列。將兩個(gè)基因的基因組與cDNA序列分別進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)兩個(gè)基因都有5個(gè)外顯子,4個(gè)內(nèi)含子。應(yīng)用蛋白質(zhì)分析軟件對(duì)這兩個(gè)cDNA序列推導(dǎo)的蛋白質(zhì)序列的理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行分析與預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示:CAD蛋白的等電點(diǎn)為5.705,分子量為38.775KDa；3個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域,有一個(gè)信號(hào)肰剪切位點(diǎn),且此蛋白是一

5、個(gè)親水蛋白,富含α螺旋和β折疊。4CL蛋白等電點(diǎn)為5.095,分子量為59.332KDa,存在4個(gè)跨膜區(qū)域,有一個(gè)信號(hào)肰剪切位點(diǎn),該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以α螺旋為主,并在其氨基酸序列上存在兩大絕對(duì)保守域,即SSGTTGLPKGV和GEICIRG,其中SSGTTGLPKGV被認(rèn)為是4CL催化反應(yīng)中保守的AMP結(jié)合功能域。
　　 3.赤桉CAD和4CL基因的原核融合表達(dá)。設(shè)計(jì)了兩對(duì)特異表達(dá)引物,分別選用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和SalⅠ、