小麥葉綠體轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究與楊樹(shù)木質(zhì)素合成相關(guān)糖基轉(zhuǎn)移酶基因克隆.pdf

1、本論文第一部分是有關(guān)小麥葉綠體轉(zhuǎn)基因技術(shù)。與核轉(zhuǎn)基因相比，葉綠體轉(zhuǎn)基因具有許多優(yōu)點(diǎn)，包括：外源基因高效表達(dá)、可以同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因、安全性好、避免基因沉默現(xiàn)象和位置效應(yīng)、可以直接表達(dá)原核基因、可以實(shí)現(xiàn)定位整合，后代遺傳穩(wěn)定等。葉綠體轉(zhuǎn)基因技術(shù)被看作是“環(huán)境友好型”的生物技術(shù)。迄今為止，葉綠體轉(zhuǎn)基因技術(shù)已成功應(yīng)用于許多雙子葉及少數(shù)單子葉植物，例如：煙草、番茄、馬鈴薯、擬南芥、油菜、萵苣、矮牽?；ā⑺镜?。然而，作為世界重要糧食作物之一的小麥

2、，至今還未成功實(shí)現(xiàn)其葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化，限制了該技術(shù)在小麥遺傳改良中的應(yīng)用。
　　 制約該技術(shù)應(yīng)用于單子葉禾本科農(nóng)作物的主要原因有：在通過(guò)幼胚誘導(dǎo)的愈傷組織中，前質(zhì)體尚未發(fā)育成綠色葉綠體，體積小，難以轉(zhuǎn)化；前質(zhì)體基因表達(dá)調(diào)控與成熟葉綠體具有很大差別；禾本科作物葉片的反復(fù)再生較為困難，極大限制了葉綠體轉(zhuǎn)基因植株同質(zhì)化。
　　 本實(shí)驗(yàn)首次以小麥為材料，對(duì)小麥葉綠體轉(zhuǎn)基因前期組培技術(shù)以及同質(zhì)化技術(shù)等關(guān)鍵技術(shù)進(jìn)行研究，以期克服小麥組

3、培方法帶來(lái)的障礙，初步探索其葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化，為今后小麥葉綠體基因工程育種打下基礎(chǔ)。論文在以下幾個(gè)方面取得了進(jìn)展：
　　 1.建立了小麥葉綠體轉(zhuǎn)基因受體材料的誘導(dǎo)和繼代技術(shù)。對(duì)小麥幼胚愈傷組織培養(yǎng)體系進(jìn)行研究，確定了濟(jì)南177(JN177)和中國(guó)春(CS)兩種小麥組織培養(yǎng)合適的接胚時(shí)間、繼代周期，明確了愈傷組織狀態(tài)與胚性的關(guān)系。幼胚的大小、狀態(tài)對(duì)于將來(lái)胚性愈傷組織的誘導(dǎo)及繼代十分重要，繼代過(guò)程中應(yīng)盡量挑選黃色致密的胚性愈傷組織進(jìn)行

4、繼代。在用小麥愈傷組織作為葉綠體轉(zhuǎn)基因的受體材料時(shí)，應(yīng)盡量使用繼代培養(yǎng)1～6個(gè)月之內(nèi)的愈傷組織，以保證較高的再生頻率。
　　 2.建立了小麥試管苗幼葉反復(fù)再生技術(shù)，為開(kāi)展小麥葉綠體轉(zhuǎn)基因同質(zhì)化研究奠定了重要的技術(shù)基礎(chǔ)。這是國(guó)內(nèi)外首次通過(guò)再生苗葉片實(shí)現(xiàn)試管苗的二次再生。己申請(qǐng)國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利(申請(qǐng)?zhí)?00910230815.8)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)比較發(fā)現(xiàn)，再生苗高度4cm左右時(shí)截取其葉片基部的l～2mm葉段進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基

5、添加2mg/L2，4-D和lmg/L NAA，分化培養(yǎng)基添加10mg/L AgN03和lmg/LTIBA時(shí)兩種小麥具有最好的愈傷組織誘導(dǎo)率和二次再生率。
　　 3.初步建立了小麥愈傷組織的轉(zhuǎn)綠技術(shù)。經(jīng)過(guò)特殊培養(yǎng)基的誘導(dǎo)培養(yǎng)，最終獲得了既具有胚性細(xì)胞特征又包含葉綠體的小麥綠色愈傷組織，這在國(guó)內(nèi)外尚屬首次。獲得的綠色愈傷組織為開(kāi)展小麥葉綠體轉(zhuǎn)基因提供了良好的受體材料。
　　 4.研究了轉(zhuǎn)化體的篩選技術(shù)。已經(jīng)確定適用于小麥葉綠

6、體轉(zhuǎn)化體的篩選劑種類(lèi)與濃度，建立了轉(zhuǎn)化體篩選的相關(guān)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)100mg/L鏈霉素具有較好的再生苗篩選效果，而愈傷組織繼代篩選的最初濃度為200mg/L鏈霉素較合適。
　　 5.嘗試進(jìn)行了小麥葉綠體的轉(zhuǎn)化。通過(guò)基因槍法對(duì)小麥愈傷組織進(jìn)行葉綠體轉(zhuǎn)化，然后通過(guò)抗生素篩選，獲得了一定數(shù)量的抗性苗并移栽。
　　 本論文第二部分是木質(zhì)素相關(guān)糖基轉(zhuǎn)移酶基因克隆。木質(zhì)素是一類(lèi)芳香族聚合物，是構(gòu)成植物細(xì)胞壁的主要成分之一。目前，對(duì)其生物合

7、成途徑較為清楚，如改變合成途徑中的關(guān)鍵酶，就能改變木質(zhì)素含量及H/G/S三種類(lèi)型木質(zhì)素之間的比例。
　　 木質(zhì)素單體在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)合成，但其聚合卻發(fā)生在細(xì)胞膜外，它們是如何跨膜運(yùn)輸?shù)侥ね庵两袢狈ρ芯俊Ｏ嚓P(guān)研究表明糖基轉(zhuǎn)移酶能改變其底物的跨膜運(yùn)輸。最近在擬南芥中發(fā)現(xiàn)一個(gè)小的基因簇，其產(chǎn)物能糖基化木質(zhì)素單體，這為木質(zhì)素單體的跨膜運(yùn)輸提供了一種假設(shè)。楊樹(shù)木質(zhì)纖維是生物質(zhì)能源工業(yè)和造紙業(yè)的重要原料，為了研究楊樹(shù)木質(zhì)素合成調(diào)控機(jī)理，本論文首次