安徽白山羊精液冷凍保存技術(shù)研究.pdf

1、安徽白山羊是我省地方山羊品種，屬于黃淮山羊的地方類群，具有繁殖力高，適應(yīng)性強(qiáng)，板質(zhì)質(zhì)量?jī)?yōu)良等特點(diǎn)。用其優(yōu)秀公羊精液進(jìn)行冷凍保存應(yīng)用可以加速該品種保種速度。本實(shí)驗(yàn)的目的是研究出適合安徽白山羊精液冷凍保存的稀釋液配方和冷凍程序，為安徽白山羊冷凍精液的實(shí)際應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　 1．選取影響精液冷凍-解凍程序效果的四個(gè)因素作為研究對(duì)象：稀釋比例、平衡時(shí)間、解凍液種類和解凍溫度。每個(gè)因素選取3個(gè)水平（種類）：A稀釋比例（原精液：稀釋液）：

2、1：2(A1)、1：3(A2)和1：4(A3)；B平衡時(shí)間：2h(B1)、3h(B2)和4h(B3)；C解凍液種類：葡3-3液(C1)，維生素B12(C2)、2.9％檸檬酸鈉(C3)；D解凍溫度：40℃(D1)、50℃(D2)、60℃(D3)，以活率、生存指數(shù)、頂體完整率和膜完整性作為評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，篩選出最佳的精液冷凍-解凍程序。經(jīng)極差分析結(jié)果顯示：1）三種稀釋比例間各評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)的極差分析值差異均不顯著(P＞0.05

3、)，但A3的極差值均大于其他兩組；2）B2精液活率優(yōu)于B3(P＜0.05)，頂體完整率優(yōu)于B1(P＜0.05)，膜完整率比B3差(P＜0.05)；3)C1活率優(yōu)于C2(P＜0.05)，膜完整性優(yōu)于C2、C3(P＜0.05)，頂體完整率優(yōu)于C3(P＜0.05)；4)D1活率優(yōu)于其他D2、D3(P＜0.05)，膜完整率和頂體完整率各組差異不顯著。
　　 綜上結(jié)果表明，最優(yōu)的冷凍-解凍程序是A3B2C1D1，即1：4稀釋，在4℃冰箱平

4、衡3h，以B12作為解凍液，解凍溫度為40℃。
　　 2．對(duì)緩沖劑進(jìn)行三步篩選。
　　 初步篩選，挑選四種緩沖劑：檸檬酸鈉(E)、Tris(F)、pipes(G)、hepes(H)，分別設(shè)計(jì)3個(gè)水平(E：0.2％、1.6％、3.0％；F：0.02％、2.42％、4.36％：G：0.1％、0.5％、1.0％；H：0.1％、0.5％、1.0％)，進(jìn)行L9(34)的正交試驗(yàn)，以解凍后精液的直觀活率檢測(cè)結(jié)果為參數(shù)進(jìn)行正交設(shè)計(jì)極差

5、分析，篩選出最佳的緩沖劑組合：E1F2G2H2。
　　 再次篩選，依據(jù)初步篩選結(jié)果，再細(xì)分四種緩沖劑的添加量，即E：0.1g％、0.2％、0.3％；F：1.8％、2.4％、3.0％；G：0.2％、0.5％、0.8％：H：0.2％、0.5％、0.8％，以精液品質(zhì)綜合指數(shù)作為正交設(shè)計(jì)的評(píng)判參數(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示各因素影響顯著性順序是E＞H＞G＞F，其中E（檸檬酸鈉）和H（hepes）對(duì)精液綜合指數(shù)影響顯著(P＜0.05)。
　

6、　 最終篩選，剔除再次篩選中差異不顯著的F(Tris)和G(pipes)，重新設(shè)計(jì)E（檸檬酸鈉）和H(hepes)的兩因素三水平的正交試驗(yàn)(E：0.2g％、1.6％、3.0％：H：0.2％、0.8％、1.6％)。結(jié)果顯示1.6％的E和1.6％的H組合添加效果最好(P＜0.05)．
　　 3．在稀釋液中添加N，N-二甲基甲酰胺(DMF)和甘油不同組合的冷凍保護(hù)劑，研究其對(duì)安徽白山羊精液冷凍效果的影響。結(jié)果表明，單一的DMF冷凍效

7、果差（P＜0.05），以甘油5％和DMF1％的組合抗凍劑效果最佳，效果優(yōu)于其他組和單一的甘油使用（P＜0.05）。
　　 4,在冷凍精液稀釋液中添加十二烷基磺酸鈉(SDS)：0.05％、0.10％、0.15％、0.20％、0.25％、0.30％．結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)十二烷基磺酸鈉添加量為0.1％時(shí)，解凍后精子活率達(dá)到65.9％，顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組（P＜0.05），精膜完整率達(dá)到54.13％，顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組(P＜0.05)：十二烷基磺

8、酸鈉添加量為0.2％時(shí)，精子頂體完整率最高，達(dá)58.46％，但與0.1％添加量相比，差異不顯著。綜合表明，0.1％的SDS添加組最優(yōu)。
　　 5．為了進(jìn)一步檢驗(yàn)新配方制作的凍精的冷凍保存效果，對(duì)55只同期發(fā)情安徽白山羊進(jìn)行了人工授精試驗(yàn)，在30天42只母羊不返情，計(jì)為妊娠，受胎率為76.4％。
　　 綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)篩選安徽白山羊精液冷凍-解凍程序和緩沖劑組合，添加DMF和SDS，取得了較好的冷凍效果，使安徽白山羊顆