小麥部分鋅指蛋白基因分子特征和調(diào)控植株耐低磷逆境的功能.pdf

1、磷是作物生長發(fā)育不可或缺的營養(yǎng)元素之一,是核酸、磷脂、蛋白質(zhì)、ATP、含磷的酶的重要組成元素,參與了植物體內(nèi)各種生理生化反應(yīng),對(duì)促進(jìn)植物生長發(fā)育和新陳代謝具有重要作用。轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植株應(yīng)答低磷等非生物逆境中發(fā)揮著重要功能,但迄今有關(guān)小麥低磷等非生物逆境下的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制尚少見報(bào)道。本研究采用生物信息學(xué)技術(shù),獲得了30個(gè)小麥WRKY型和5個(gè)TFⅢA型鋅指蛋白型轉(zhuǎn)錄因子基因,對(duì)上述基因的分子特征進(jìn)行了分析。采用基因遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù),對(duì)其中3個(gè)對(duì)

2、低磷具有明顯應(yīng)答的基因進(jìn)行了煙草遺傳轉(zhuǎn)化,鑒定了其抵御低磷逆境的生物學(xué)功能。主要研究結(jié)果如下。
　　 1、以植物種屬保守WRKY結(jié)構(gòu)域TFⅢA型鋅指蛋白保守域?yàn)榛A(chǔ),在GenBanK查找小麥中提交的含有保守域特征的同源基因。獲得30個(gè)小麥WRKY型和5個(gè)TFⅢA型鋅指蛋白型轉(zhuǎn)錄因子基因。采用基因特異引物組合進(jìn)行RT-PCR檢測(cè),其中16個(gè)WRKY型成員和所有5個(gè)TFⅢA型鋅指蛋白得到擴(kuò)增。
　　 2、WRKY型成員中除W

3、RKY5、WRKY11和WRKY19均含有2個(gè)WRKY域和鋅指域外,其他成員均含有1個(gè)WRKY域和1個(gè)鋅指域。不同基因成員的cDNA序列長度、開放閱讀框長度和編碼氨基酸數(shù)目變幅較小。根據(jù)WRKY域和鋅指結(jié)構(gòu)域特征,WRKY型蛋白可劃分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型3個(gè)類別,數(shù)量分別為3、15和12個(gè)。5個(gè)TFⅢA型蛋白都含有該類別蛋白通常含有的保守基序(QALGGH),且該保守基序位于C2H2鋅指域內(nèi)。
　　 3、低磷脅迫下,TaWRKY1

4、2、TaWRKY20和TaWRKY29隨處理時(shí)間延長表達(dá)量逐漸增加,TaWRKY19處理后一直維持在高水平的表達(dá)量,其余基因的表達(dá)在處理后3 h或13 h或以后的增強(qiáng)較為明顯；TaWRKY8和TaWRKY15的表達(dá)量下降最為明顯,基本檢測(cè)不到表達(dá)；TaWRKY3、TaWRKY4和TaWRKY21在處理3 h后與對(duì)照表達(dá)量相近,但隨處理時(shí)間延長表達(dá)量有所下降。TaWRKY16、TaWRKY17和TaWRKY27處理后各時(shí)間點(diǎn)均維持一定的表

5、達(dá)量,但都低于對(duì)照；TaWRKY25在低磷脅迫處理下的表達(dá)量與對(duì)照無明顯差別,為組成型表達(dá)。
　　 4、在低磷、低氮、低鉀、低鈣、低鋅、ABA、干旱(PEG)、鹽分(NaCl)和低溫(4℃)等處理下,16個(gè)WRKY基因中各成員均對(duì)多個(gè)或全部處理產(chǎn)生應(yīng)答；5個(gè)ZFP型基因?qū)Φ土酌{迫均呈上調(diào)表達(dá)特征。其中TaZFP2還對(duì)低氮、干旱和鹽分上調(diào)表達(dá)。上述基因?qū)Ω鞣N逆境應(yīng)答主要表現(xiàn)為上、下調(diào)兩種類型。在應(yīng)答程度上,同樣為上調(diào)或下調(diào)的類別中

6、,表現(xiàn)的應(yīng)答程度具有較大變異。表明小麥WRKY型和ZFP型鋅指蛋白類轉(zhuǎn)錄因子參與了多種脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和轉(zhuǎn)錄調(diào)控途徑,通過彼此互作,在植物體內(nèi)形成一個(gè)復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
　　 5、采用DNA重組和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù),構(gòu)建了將TaWRKY12、TaWRKY18和TaZFP2開放閱讀框(ORF)融合至雙元表達(dá)載體的重組質(zhì)粒,建立了上調(diào)表達(dá)上述基因的轉(zhuǎn)基因植株。對(duì)低磷處理下的植株表型觀測(cè)發(fā)現(xiàn),在低磷處理下,遺傳轉(zhuǎn)化上述外源基因

7、的轉(zhuǎn)基因植株長勢(shì)均較對(duì)照明顯改善。與對(duì)照相比,轉(zhuǎn)基因植株株高增大,葉間距和葉片面積變大,葉片無機(jī)磷和總磷含量增加,植株的可溶蛋白含量和酸性磷酸酶活性提高。此外,轉(zhuǎn)基因植株的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量也均明顯高于對(duì)照。
　　 6、研究表明,TaWRKY12、TaWRKY18和TaZFP2可能是植物應(yīng)答磷素缺乏信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的重要調(diào)控組分。上調(diào)表達(dá)上述基因,能誘導(dǎo)低磷逆境下植株中磷素吸收和利用部分相關(guān)基因的增強(qiáng)表達(dá),具有改善