應(yīng)用PCR法檢測生物制品中支原體污染.pdf

1、支原體(Mycoplasma)是一類缺乏細(xì)胞壁的最小原核細(xì)胞型微生物，它結(jié)構(gòu)簡單，大小介于病毒和細(xì)菌之間。自1956年第一次檢測到細(xì)胞培養(yǎng)物中存在支原體污染以來，支原體污染細(xì)胞培養(yǎng)物這個世界性問題持續(xù)了半個多世紀(jì)，獸用活疫苗中存在支原體污染的事例同樣屢見不鮮，嚴(yán)重影響了疫苗的純凈性，降低疫苗的質(zhì)量進(jìn)而引發(fā)支原體感染，給畜牧業(yè)及疫苗生產(chǎn)企業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。為了預(yù)防及控制支原體污染，減少支原體污染帶來的危害，各種檢測技術(shù)被應(yīng)用到支原體污

2、染的檢測領(lǐng)域中，各國相繼建立了支原體的檢測方法。我國對支原體污染的研究工作起步較晚，支原體污染的檢測技術(shù)有待改進(jìn)。
　　 為了完善生物制品中支原體污染的檢測技術(shù)，本研究針對口腔支原體(Ora)、精氨酸支原體(Arg)、發(fā)酵支原體(Fer)、萊氏無膽甾原體(Ala)、豬鼻支原體(Mho)、豬肺炎支原體(Mhp)、雞毒支原體(Mg)、牛支原體(Mbo)、衣阿華支原體(Mi)、滑液支原體(Ms)、絮狀支原體(Mf)、火雞支原體(Mm)

3、、雞支原體(Gal)、鴨支原體(Ma)，共計14種污染生物制品的常見支原體設(shè)計引物，建立PCR檢測方法，并應(yīng)用此方法對多種生物制品進(jìn)行檢測。主要試驗結(jié)果如下:
　　 1.生物制品中支原體污染的PCR檢測方法的建立對14種支原體標(biāo)準(zhǔn)株的基因組序列進(jìn)行分析，自行設(shè)計出一對可以檢測這14種支原體的通用引物，同時培養(yǎng)這14種支原體，獲取DNA模板，進(jìn)行PCR擴增反應(yīng)。結(jié)果顯示14個模板均有目的片段，且片段大小在440bp～467bp之間

4、，以此建立生物制品中支原體污染的PCR檢測方法，擴大污染生物制品的支原體檢測范圍。
　　 2.生物制品中支原體污染的PCR檢測方法的敏感性及特異性試驗使用顏色變化單位法（CCU法）檢測出8種支原體培養(yǎng)物的濃度后，對已建立的PCR檢測方法進(jìn)行敏感性試驗。結(jié)果顯示，此方法可以檢測到8種支原體的最小濃度在1CCU～10CCU之間;在特異性試驗中，選取各類細(xì)菌及病毒14種作對照，結(jié)果14種對照均不發(fā)生擴增反應(yīng)。試驗結(jié)果說明此PCR檢測方

5、法敏感性良好，特異性強。
　　 3.生物制品中支原體污染的PCR檢測方法的應(yīng)用應(yīng)用此方法對10種獸用活疫苗中71個批次的樣品和11種細(xì)胞系的24份傳代細(xì)胞樣品進(jìn)行支原體污染檢測，結(jié)果有3份疫苗樣品為陽性、6份細(xì)胞樣品為陽性。在對比其他支原體污染的檢測方法中，已建立的PCR檢測方法與培養(yǎng)法、DNA熒光染色法的檢測結(jié)果均相同，但商品化支原體PCR檢測試劑盒主要針對污染細(xì)胞的5種支原體有擴增反應(yīng)，其檢測結(jié)果是2份疫苗樣品為陽性、6份細(xì)