楊樹木質部特異性啟動子的功能及JCesAP關鍵調(diào)控域研究.pdf

1、楊樹是我國的主要樹種之一，具有生長迅速、適應性強、易雜交、易改良等優(yōu)良特性。隨著園林綠化事業(yè)的發(fā)展，楊樹在我國環(huán)境建設中也發(fā)揮著愈加重要的作用。但由于天牛類蛀干害蟲嚴重危害楊樹，而且采用傳統(tǒng)防治技術難以見效且污染環(huán)境，所以利用植物基因工程技術防治天牛類蛀干害蟲成為有效解決這一問題的有效措施。
　　本研究將前期從楊樹中分離到的啟動子融合報告基因的植物表達載體轉化楊樹及煙草，通過對轉基因植物中不同組織、器官GUS報告基因的定量活性檢測

2、，從而篩選具有木質部組織特異性啟動子。通過定量檢測創(chuàng)傷及ABA激素刺激條件下，轉基因楊樹不同器官的GUS酶活性，來分析不同啟動子對創(chuàng)傷及ABA激素誘導的響應情況。并采用5'端缺失分析方法，對前期從加楊中分離得到的木質部特異啟動子JCesAP，利用模式植物作為轉基因體系，分析啟動子不同區(qū)段驅動GUS基因在轉基因植物中的表達能力和水平。明確各調(diào)控元件的結構與功能及相互之間的關系、確定控制木質部組織特異性及誘導活性的調(diào)控元件。主要研究結果如下

3、:
　　(1)采用農(nóng)桿菌介導法獲得含有三個植物表達載體PMDCesAP-GUS、PJCesAP-GUS、PDMDCesAP-GUS的轉基因植株。GUS組織化學染色結果表明，植物材料葉脈、葉肉都顯示藍色，說明MDCesAP、JCesAP、DMDCesAP都具有啟動子活性。而且MDCesAP葉脈與葉肉比較顯示明顯的深藍色，說明具有明顯的木質部組織特異性。通過GUS定量活性檢測結果表明:MDCesAP是3個啟動子中功能最強的，且具有木質

4、部組織特異性;與葉、莖比較，串聯(lián)改造后的DMDCesAP啟動子在根部組織特異性最高;與根、莖比較，JCesAP啟動子在葉部組織特異性最高。
　　(2)以融合PMDCesAP-GUS、PJCesAP-GUS、PDMDCesAP-GUS的轉基因楊樹作為實驗材料，分別對其根、莖、葉進行創(chuàng)傷及ABA(脫落酸Abscisie Acid)激素誘導處理，通過定量檢測轉基因楊樹不同器官的GUS酶活性，來分析不同啟動子對創(chuàng)傷及ABA激素誘導的響應情

5、況。結果表明，創(chuàng)傷處理轉基因楊樹12h時，PMDCesAP的根的GUS酶活達到最高點。ABA激素處理轉基因楊樹，PDMDCesAP、PJCesAP在根中的GUS酶活是先升高、降低、升高再降低的趨勢，處理0h時PDMDCesAP的GUS酶活最高;PMDCesAP的根、莖在ABA激素處理前GUS酶活處于最大值。
　　(3)以融合PMDCesAP-GUS、PJCesAP-GUS、PDMDCesAP-GUS的轉基因煙草作為實驗材料，分別對

6、其根、莖、葉進行創(chuàng)傷及ABA激素誘導處理，通過定量檢測轉基因煙草不同器官的GUS酶活性，來分析不同啟動子對創(chuàng)傷及ABA激素誘導的響應情況。結果表明，創(chuàng)傷處理轉基因煙草24h時，PJCesAP的根的GUS酶活達到最高點。ABA激素處理轉基因煙草，PMDCesAP在根中的GUS酶活是降低、升高、降低、升高的變化規(guī)律;PJCesAP在根、葉中的GUS酶活是先升高再降低的變化規(guī)律;PDMDCesAP的根在ABA激素處理前GUS酶活處于最大值。<

7、br>　　((4)將GUS作為報告基因，構建了JCesAP啟動子的一系列植物缺失表達載體，并通過農(nóng)桿菌介導轉化模式植物的方法對啟動子的缺失片段活性進行分析。采用瞬時檢測功能分析結果表明，L2、 L3和L4三個啟動子缺失片段均具有啟動予功能。在得到的穩(wěn)定表達的轉基因煙草植株中，經(jīng)過GUS組織化學染色可知，L2葉片表面有明顯的藍色區(qū)域，L3和L4需要在顯微鏡下仔細觀察方能看出藍色，不太明顯，表明L2、L3和L4啟動子都具有啟動子活性，L2的