小麥脫鎂吐綠酸α加氧酶基因(TaPaO)的克隆及表達(dá)分析.pdf

1、在高等植物中，健康生長(zhǎng)的葉片對(duì)光合作用來(lái)說(shuō)是至關(guān)重要的。然而，葉片的衰老將會(huì)導(dǎo)致光合作用能力的下降。葉片衰老是植物葉片發(fā)育的最后階段，最終導(dǎo)致整個(gè)葉片的死亡。葉片衰老被認(rèn)為是一種具有高度組織性的由基因控制的程序化死亡過(guò)程。在細(xì)胞水平上表現(xiàn)為葉綠素的降解、蛋白質(zhì)和核酸的水解、游離氨基酸積累以及多種蛋白酶和生長(zhǎng)抑制因子活性上調(diào)等。其中，葉綠素降解是葉片衰老過(guò)程中最明顯的現(xiàn)象。在葉綠素的降解中，脫鎂葉綠酸α加氧酶(pheophorbideαo

2、xygenase，PaO)被認(rèn)為是最重要的酶。PaO通過(guò)催化氧原子的加入，使脫鎂葉綠酸α的卟啉環(huán)開(kāi)環(huán)，形成紅色葉綠素降解物(red chlorophyll catabolite，RCC)。PaO基因最早在玉米中被發(fā)現(xiàn)，后從多種植物中被分離出來(lái)。本研究以重要的糧食作物小麥(Triticum aestivum)為實(shí)驗(yàn)材料，首次從小麥中克隆得到PαO基因，并對(duì)其進(jìn)行了序列分析和表達(dá)特異性分析，為進(jìn)一步明確PaO的功能及作用機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。主要

3、研究結(jié)果如下：
　　 (1)利用生物信息學(xué)分析方法和RACE技術(shù)，從小麥中克隆得到了一個(gè)PαO基因，并命名為T(mén)αPαO(GenBank注冊(cè)號(hào)：JN689384)。該基因cDNA全長(zhǎng)1841bp，包括1572bp的開(kāi)放閱讀框(open reading frame，ORF)，48bp的5’非編碼區(qū)(untranslated region，UTR)和221bp的3’UTR。該基因編碼由523個(gè)氨基酸組成的蛋白TaPaO，預(yù)測(cè)其分子量大

4、約為58.3kDa，等電點(diǎn)(isoelectricpoint，pI)值為7.17。進(jìn)一步的分析預(yù)測(cè)顯示，TaPaO蛋白定位在葉綠體，其N(xiāo)端具有由38個(gè)氨基酸組成的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，剪切位點(diǎn)位于R38和V39之間。TaPaO具有PaO蛋白特有的保守結(jié)構(gòu)域，包括Rieske型(2Fe-2S)結(jié)構(gòu)域、單核鐵結(jié)合結(jié)構(gòu)域和C末端CxxC基序。蛋白質(zhì)序列同源比較表明，TaPaO與其它植物的PaO蛋白具有很高的同源性。TaPaO與HvPaO、SbPaO、

5、ZmPaO、AtPaO、GmPaO的同源性分別達(dá)到了93％，83％，79％，69％和65％。聚類(lèi)分析表明，TaPaO與大麥HvPaO的親緣關(guān)系最近。
　　 (2)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法，研究了TaPaO在小麥幼苗不同組織中的表達(dá)特性。結(jié)果表明，TaPaO在根莖葉中均能表達(dá)，TaPaO在葉片中的表達(dá)量明顯高于其在莖和根中的表達(dá)量。
　　 (3)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法，對(duì)外源施加植物激素的小麥植株中TaPaO的表

6、達(dá)進(jìn)行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在脫落酸(abscisic acid，ABA)和茉莉酸甲酯(methyl jasmonate，MeJA)的誘導(dǎo)下，TaPaO基因的表達(dá)都有不同程度的增加，然而赤霉素(gibberellin，GA)和水楊酸(salicylic acid，SA)對(duì)TaPaO基因的表達(dá)并沒(méi)有顯著的影響。這表明TaPaO的表達(dá)可能受ABA和MeJA依賴(lài)的防御信號(hào)途徑的調(diào)控。
　　 (4)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法，對(duì)各種非生物