cd4+t細胞亞群在血吸蟲蟲卵肉芽腫形成中的作用-免疫學(xué)

1、<p><b>　　主要英文縮略語索引</b></p><p>　英文全稱縮寫詞中文名稱</p><p>　antigen presenting cellAPC抗原提呈細胞</p><p>　bicinchoninic acidBCA二喹啉甲酸</p><p>　bovine serum albuminBSA牛

2、血清白蛋白</p><p>　base pairbp堿基對</p><p>　complementary DNAcDNA互補DNA</p><p>　cytokinesCKs細胞因子</p><p>　diethyl-pryocarbonateDEPC焦碳酸二乙酯</p><p>　deoxyribonucleic a

3、cidDNA脫氧核糖核酸</p><p>　deoxynucldeoside triphosphatedNTP脫氧三磷酸核苷酸</p><p>　ethylene diamietetraacetic acidEDTA乙二胺四乙酸</p><p>　enzyme-linked immunosorbent assayELISA酶聯(lián)免疫吸附測定</p>&

4、lt;p>　fetal bovine serumFBS胎牛血清</p><p>　fluorescein isothiocynateFITC異硫氰酸熒光素</p><p>　flow cytometryFCM流式細胞術(shù)</p><p>　forkhead box P3Foxp3叉頭狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子</p><p>　hematoxylin

5、-eosinHE蘇木精—伊紅</p><p>　horseradish peroxidaseHRP辣根過氧化物酶</p><p>　interferon-γ IFN-γγ干擾素</p><p>　interleukin-2IL-2白細胞介素-2</p><p>　interleukin-12IL-12白細胞介素-12</p>

6、<p>　interleukin-23IL-23白細胞介素-23</p><p>　interleukin-4IL-4白細胞介素-4</p><p>　interleukin-6IL-6白細胞介素-6</p><p>　interleukin-10IL-10白細胞介素-10</p><p>　interleukin-17IL-17

7、白細胞介素-17</p><p>　interleukin-1βIL-1β白細胞介素-1β</p><p>　message RNAmRNA信使RNA</p><p>　optical densityOD光密度</p><p>　phosophate buffered salinePBS磷酸鹽緩沖液</p><p>　

8、tween-20 phosphate buffer solutionPBSTTween-20磷酸緩沖液</p><p>　polymerase chain reactionPCR聚合酶鏈式反應(yīng)</p><p>　peridinin chlorop hyllproteinPerCP多甲藻黃素葉綠素蛋白質(zhì)復(fù)合物</p><p>　phycoerythrinPE藻紅蛋白熒

9、光素</p><p>　pathogen-associated molecular patternsPAMPs病原相關(guān)分子模式</p><p>　revolutions per minuterpm每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)</p><p>　roswell park memorial institute-16401640 Medium RPMI-1640RPMI-1640培養(yǎng)基&l

10、t;/p><p>　retinoid-related orphan nuclear receptorROR-γt孤核受體</p><p>　real-time PCRReal-time PCR熒光實時定量PCR</p><p>　reverse transcriptase polymerase chain reactionRT-PCR逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)</p&g

11、t;<p>　pattern recognition receptorsPRRs模式識別受體</p><p>　solube egg antigenSEA蟲卵可溶性抗原</p><p>　Schistosoma japonicum Sj日本血吸蟲</p><p>　Schistosoma japonicum solube egg antigenSjSE

12、A日本血吸蟲蟲卵可溶性抗原</p><p>　transforming growth factor-βTGF-β轉(zhuǎn)化生長因子β</p><p>　helper T cellTh輔助性T細胞</p><p>　T help cell 17Th17Th17細胞</p><p>　T follicular helper cellsTfh濾泡輔助性T

13、細胞</p><p>　tumor necrosis factor-αTNF-α腫瘤壞死因子-α</p><p>　regulatory T cellTreg調(diào)節(jié)性T細胞</p><p>　world health organizationWHO世界衛(wèi)生組織</p><p><b>　　中 文 摘 要</b></p

14、><p><b>　　目 的：</b></p><p>　　通過構(gòu)建日本血吸蟲病Balb/c小鼠模型，研究CD4+T細胞亞群及其Th1/Th2、Th17/Treg失衡在日本血吸蟲病肝蟲卵肉芽腫形成中的作用，完善日本血吸蟲致病機制，為血吸蟲病治療提供新的靶標。</p><p><b>　　方 法：</b></p>

15、<p>　　用日本血吸蟲尾蚴感染Balb/c小鼠，構(gòu)建4w、6w、8w、10w、12w、16w、20w、24w不同時間點日本血吸蟲病小鼠模型，采用FCM檢測各組小鼠肝臟和脾臟中CD4+T細胞亞群中Th1、Th2、Th17及Treg細胞百分比與比值變化；ELISA檢測小鼠血清中相關(guān)細胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β及IL-1β水平；Trizol法提取肝組織mRNA，r

16、eal-time PCR檢測肝臟組織中IL-2、IFN-γ、IL-12、IL-4、IL-10、IL-6、IL-23、IL-17、ROR-γt、Foxp3、TGF-β及IL-1β等分子mRNA表達水平；取小鼠肝組織切片，HE和Masson染色法觀察肝臟病理變化。</p><p><b>　　結(jié) 果：</b></p><p>　　小鼠肝組織切片HE染色及Masson染色觀

17、察到感染小鼠肝組織均發(fā)生不同程度的炎癥反應(yīng)；8w時出現(xiàn)了嚴重的蟲卵肉芽腫和輕度膠原蛋白纖維沉積，第12w 膠原纖維蛋白量達高峰，肝臟炎癥反應(yīng)和病變以8w～12w最為嚴重；16w后炎癥反應(yīng)開始減輕，20w～24w炎癥反應(yīng)進一步減輕，形成大量纖維瘢痕病灶，蟲卵死亡液化形成空洞。</p><p>　　FCM結(jié)果顯示：Th1和Th2細胞的百分比在感染組小鼠肝臟和脾臟顯著性高于正常對照組，P<0.05，肝組織中Th1

18、細胞比例在血吸蟲感染第4w和16w為高峰值，Th2細胞比例在血吸蟲感染第8w達高峰；脾組織中Th1、Th2細胞的走勢與肝臟相一致。Th1/Th2比值在血吸蟲感染第4w顯著性升高并達峰值；感染第6w時，Th1/Th2比值出現(xiàn)倒置，持續(xù)至12w時，而感染第16w時，Th1細胞比例顯著性升高，Th2細胞比例顯著性下降，Th1/Th2比值顯著性升高，肝脾Th1/Th2比值走勢相一致。</p><p>　　Th17和Tre

19、g細胞百分比在感染組小鼠肝臟和脾臟均顯著性高于正常對照組，P<0.05，肝組織中IL-17A+Th17和 IL-17F+Th17細胞比例在血吸蟲感染第8w和16w為高峰值，Treg細胞比例在血吸蟲感染第8w達峰值，脾組織中Th17、Treg細胞的走勢與肝臟相一致。各感染組小鼠Th17/Treg比值均顯著性高于正常對照組，且感染第16w達峰值，肝脾Th17/Treg比值走勢相一致。</p><p>　　rea

20、l-time PCR結(jié)果顯示：感染小鼠肝臟組織中IL-2、IFN-γ、IL-12、IL-4、IL-10、IL-6、IL-23、IL-17、ROR-γt、Foxp3、TGF-β及IL-1β mRNA的表達量均顯著性高于正常對照組，P<0.05，其中IFN-γ、IL-12和IL-2 mRNA表達量在感染4w達峰值，第16w出現(xiàn)第二個高峰值，與Th1細胞升高的時間點相一致；IL-4和IL-10 mRNA表達量在感染第8w達峰值，與Th2

21、細胞升高的時間點相一致； IL-23、IL-17、ROR-γt mRNA表達量在感染第8w達峰值，第16w出現(xiàn)第二個高峰值，與Th17細胞升高的時間點相一致，F(xiàn)oxp3和TGF-β mRNA表達量在感染第8w達峰值，與Treg細胞升高的時間點相一致；IL-1β和IL-6 mRNA表達量在感染第8w達峰值，第16w出現(xiàn)第二個高峰值。</p><p>　　ELISA檢測結(jié)果顯示：小鼠血清IL-2、IFN-γ、IL-4

22、、IL-10、IL-6、IL-23、IL-17、TGF-β、及IL-1β的表達量均顯著性高于正常對照組，P<0.05，其中IL-2、IFN-γ含量在感染第4w、16w達峰值；IL-4、IL-10含量在感染第8w達峰值； IL-23 、IL-17含量在感染第8w達峰值；第16w出現(xiàn)第二個高峰值；TGF-β含量在感染第8w達峰值；IL-6、IL-1β含量在感染第8w、10w和16w為高水平值；ELISA檢測結(jié)果與real-time P

23、CR結(jié)果相吻合。</p><p>　　結(jié) 論: </p><p>　　小鼠感染日本血吸蟲后，隨著肝臟病理損傷程度的增加，Th2、Th17及Treg細胞百分比顯著性升高，導(dǎo)致Th1/Th2及Th17/Treg細胞比例嚴重失衡，Th2、Th17細胞及相關(guān)細胞因子增高程度與肝蟲卵

24、肉芽腫病變嚴重程度相一致，說明Th2和Th17細胞共同作用及其Th1/Th2、Th17/Treg細胞比值失衡在日本血吸蟲病肝臟免疫病理損傷中發(fā)揮重要作用。</p><p>　　關(guān)鍵詞：CD4+T細胞亞群；Th1/Th2；Th17/Treg；血吸蟲??；肝蟲卵肉芽腫</p><p>　　CD4 + T cell subsets in the role of schistosomiasis eg

25、g granuloma formation</p><p><b>　　ABSTRACT</b></p><p>　　Objectives: </p><p>　　The roles of CD4+T cell subsets and ratio of Th1/Th2 and Th17/Treg during the formation pro

26、cess of schistosomiasis liver egg granuloma were researched by building the schistosomiasis japonicum Balb/c mice model, in order to improve the pathogenic mechanism of schistosoma japonicum and provide new targets for t

27、reating schistosomiasis.</p><p><b>　　Methods：</b></p><p>　　The Balb/c mice were infectedwith schistosoma japonicum cercaria. The mice models of schistosomiasis japonicum in different

28、 time points of 0w, 4w, 6 w，8w, 10w, 12w ,16w, 20w and 24w were builded. The percentages of Th1, Th2, Th17 and Treg cells in the CD4+T subgroups in liver and spleen were detected by FCM. The relevant cytokines level of I

29、L-2, IFN-γ, IL-4, IL-10, IL-17, IL-6, IL-23, TGF-β and IL-1β were assayed by ELISA. Using Trizol method to extract the mRNA of liver tissue, the mRNA express</p><p>　　ROR-γt,Foxp3,TGF-β and IL-1β were identi

30、fied by real-time PCR. The pathological changes of liver tissue in mice models of schistosomiasis japonicum were observed by HE and Masson staining.</p><p><b>　　Results：</b></p><p>　

31、　The liver tissue slices of ervery group mice through HE staining and Masson staining were observed. The results showed that infected mice liver tissues emerged inflammation with different degrees, serious egg granulomas

32、 and mild fibrosis appeared in infected 8w. The degree of liver fibrosis became severe in 12w, the inflammatory reaction and pathological changes of liver in 8w~12w infected mice were the most severe in all infected time

33、 points. The inflammatory response alleviated after infected </p><p>　　The FCM results showed that the percentages of Th1 and Th2 cells in liver and spleen of infected mice were significantly higher than tha

34、t in control group (P<0.05), and the percentages of Th1 cell in liver of infected mice reached the peaks at 4 w and 16 w, while the percentage of Th2 cell in liver of infected mice reached a peak at 8w. The percentage

35、 profiles of Th1 and Th2 cells in spleen were as same as that in liver. The ratio of Th1/Th2 in infected mice was significantly increased and reach</p><p>　　The FCM results showed that the percentages of Th1

36、7 and Treg cells in liver and spleen of infected mice were significantly higher than that in control group (P<0.05), and the percentages of IL-A+Th17 and IL-17F+Th17 cells in liver of infected mice reached the peaks a

37、t 8w and 16w, while the percentage of Treg cell in liver of infected mice reached a peak at 8w. The percentage profiles of Th17 and Treg cells in spleen were as same as that in liver. The ratio of Th17/Treg in infected m

38、ice was signi</p><p>　　The real-time PCR results showed that the mRNA expression levels of IL-2、IFN-γ、IL-12、IL-4、IL-10、IL-6、IL-23、IL-17、ROR-γt、Foxp3、TGF-β and IL-1β in the liver tissue of infected mice were

39、significantly higher than that in control group (P<0.05). The mRNA expression levels of IFN-γ and IL-12 reached a peak at infected 4w, and the levels of IL-2 reached the peaks at infected 4w and 16w, which were consis

40、tent with the Th1 cells proliferated time point. The mRNA expression levels of IL-4 and IL-10 reach</p><p>　　The ELISA results showed that the expression levels of IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-6、IL-23、IL-17、TGF-

41、β and IL-1β in serum of infected mice were significantly higher than that in control group (P<0.05). The levels of IFN-γ and IL-2 reached the peaks at infected 4w and 16w. The levels of IL-4 and IL-10 reached a peak a

42、t infected 8w. The levels of IL-17 and IL-23 reached the peaks at infected 8w and 16w. The levels of TGF-β reached a peak at infected 8w. The levels of IL-6 and IL-1β at infected 8w and</p><p>　　Conclusions：

43、</p><p>　　After mice infected with schistosoma japonicum, along with the increase of the liver pathological damage degree, that percentages of Th2, Th17 and Treg cells significantly increased leaded to the r

44、atios unbalance of Th1/Th2 and Th17/Treg. The increasing degree of the percentages of Th2 and Th17 and the levels of related cytokines were corresponding with the liver egg granulomas damage severe degree，the combined ac

45、tion of Th2 and Th17 cells and the ratios imbalance of Th1/Th2 and Th17/Treg playe</p><p>　　Postgraduate:Chen Shan Shan</p><p>　　(Major in Immunology)</p><p>　　Directed by Professo

46、r: Jianhua Xiao</p><p>　　Key words：CD4+T cell subsets; Th1/Th2; Th17/Treg; Schistosomasis; </p><p>　　Liver egg granulomas</p><p><b>　　前 言</b></p><p>　　日

47、本血吸蟲病是一種人獸共患寄生蟲病它嚴重危害人類健康的，也是一種免疫病理性疾病。其致病機制是由于成蟲寄生于宿主的門靜脈系統(tǒng)，雌蟲產(chǎn)卵沉著于宿主肝、腸等組織，其卵內(nèi)的毛蚴分泌蟲卵可溶性抗原（soluble egg antigen，SEA）釋放入宿主組織，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生了病理性免疫應(yīng)答，促進了蟲卵肉芽腫生成和肝、腸纖維化[1-2]。血吸蟲病的主要損傷及危害是肝臟的蟲卵肉芽腫病變和肝纖維化，如何控制血吸蟲蟲卵肉芽腫形成與發(fā)生發(fā)展也是血吸蟲病研究工

48、作的重點，只有深入研究蟲卵肉芽腫及纖維化形成的機制，才能更有效的在血吸蟲病的防治上有新的突破。</p><p>　　T細胞產(chǎn)生的免疫應(yīng)答是細胞免疫，T細胞根據(jù)其CD分子又可分為CD4+T和CD8+T細胞，CD8+T細胞特異性與靶細胞結(jié)合，直接殺傷靶細胞；CD4+T細胞通過釋放細胞因子，使免疫效應(yīng)擴大和增強。CD4+T細胞又稱之輔助性T細胞，可分為Th1、Th2、Th17、Treg及Tfh細胞亞群，Tfh細胞亞群主

49、要輔助B細胞介導(dǎo)體液免疫。在正常狀態(tài)下，Th1/Th2、Th17/Treg處于動態(tài)平衡，調(diào)節(jié)機體正常的免疫應(yīng)答，一旦這種平衡態(tài)打破，將發(fā)生各種免疫病理反應(yīng)，導(dǎo)致相關(guān)疾病。</p><p>　　Thl 細胞主要通過分泌IL-2、IFN-γ和IL-12等細胞因子，而Th2細胞則主要通過分泌IL-4、IL-10、IL-5及IL-6等細胞因子。目前認識到Thl/Th2細胞的失衡與感染性疾病、自身免疫病及腫瘤密切相關(guān)。一般

50、認為Thl型細胞免疫應(yīng)答作為免疫防御應(yīng)答能夠增強宿主對病毒和胞內(nèi)病原體感染的防御，而Th2型細胞免疫應(yīng)答則與感染的進展、持續(xù)和慢性化有關(guān)。在小鼠模型中血吸蟲感染的免疫過程，既有Th1型細胞免疫應(yīng)答，又有Th2型細胞免疫應(yīng)答，兩者之間存在相互調(diào)節(jié)機制，維持著動態(tài)的免疫平衡[3-4]，但僅僅Th1型和Th2型免疫應(yīng)答并不能完全解釋血吸蟲感染后的肝組織內(nèi)大量炎性細胞因子表達和嚴重的炎癥反應(yīng)，以及較為快速地轉(zhuǎn)化為星狀細胞增生和膠原蛋白沉積等纖維

51、化病變[5]。</p><p>　　Th17和Treg細胞是不同于經(jīng)典的Th1和Th2細胞亞群的CD4+T細胞亞群，具有獨立的分化和調(diào)節(jié)機制[6]。Th17細胞是低濃度的TGF-β和IL-6共同誘導(dǎo)初始Th細胞分化的，Treg細胞是高濃度的TGF-β誘導(dǎo)初始Th細胞分化的[7]。目前研究證實Thl7細胞在自身免疫性疾病、感染性疾病和炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用[8-9]。而Treg細胞是一類表達CD4、CD25、Fo

52、xp3的Th細胞亞型，其功能主要為免疫抑制，可能通過分泌IL-10和TGF-β等免疫抑制相關(guān)細胞因子發(fā)揮作用，在抑制抗感染免疫的同時可減輕免疫反應(yīng)對機體造成的炎癥損傷。研究發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+Treg細胞功能失衡與人類多種重大疾病，如自身免疫病、感染性疾病、過敏性疾病，惡性腫瘤及移植排斥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展和治療有密切關(guān)系[10]。目前有研究報道，Treg細胞可通過分泌IL-10和TGF-β誘導(dǎo)肝包蟲病局部肝組織發(fā)生纖維化[11]。Th17

53、細胞與Treg細胞在功能和分化過程中相互對抗，在正常情況下兩者保持平衡，有利于機體免疫穩(wěn)定狀態(tài)的維持，若兩者失衡就會產(chǎn)生一系列免疫病理反應(yīng)。目前認為Th17/Treg細胞的數(shù)量或功</p><p><b>　　實 驗 材 料</b></p><p><b>　　1．實驗動物</b></p><p>　　SPF級飼養(yǎng)的健康B

54、alb/c小鼠，6-8周齡，20-22克，購南華大學(xué)動物部。</p><p>　　陽性釘螺，購于岳陽血防所。</p><p><b>　　2．主要實驗試劑</b></p><p>　　2.1抗體、主要酶類、試劑及試劑盒</p><p>　　PerCP-Cy5.5 Anti-Mouse CD3e antibody (Cat

55、: 45-0031-80)；</p><p>　　APC Anti-Mouse CD4 antibody (Cat: 17-0042-81)；</p><p>　　APC Anti-Mouse IL-4 antibody (Cat: 12-7041-41)；</p><p>　　FITC Anti-Mouse IFN-γantibody (Cat: 12-7311-

56、82)；</p><p>　　Alexa Fluor 488 Anti-Mouse/Rat Foxp3 antibody (Cat: 53-5773-80)；</p><p>　　PE Anti-Mouse CD25 antibody (Cat: 12-0251-81)；</p><p>　　PE Anti-Mouse IL-17F antibody (Cat: 1

57、2-7471-80)；</p><p>　　FITC Anti-Mouse IL-17A antibody (Cat: 11-7177-80)；</p><p>　　Alexa Fluor 488 Rat IgG2a K Isotype Control antibody (Cat: 53-4321-80)；</p><p>　　PE Mouse IgG2a K Is

58、otype Control (Cat: 12-4724-41)；</p><p>　　FITC Mouse IgG2a K Isotype Contro (Cat: 11-4724-41)；</p><p>　　以上抗體均購自于美國eBioscience 公司。</p><p>　　透明質(zhì)酸酶（Type V）(Cat: 3506)；</p><p

59、>　　Dnase I (Cat: D5025)；</p><p>　　Collagenase IV (Cat: IV C5138)；</p><p>　　collagenase I (Cat: C0130)；</p><p>　　以上酶類均購自美國Sigma公司。</p><p>　　胰蛋白酶：購自北京拜爾迪診斷技術(shù)有限公司。<

60、;/p><p>　　Trizol：購自上海北諾生物科技有限公司。</p><p>　　逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（RrimescriptTM RT reagent Kit,code:DRR037S）購自大連寶生物工程有限公司。</p><p>　　Real Time PCR Kit（Cat: QP-01011）購上海研卉生物科技有限公司。</p><p>　　

61、Mouse TGF-beta1 ELISA 試劑盒 (Cat: 88-7272-88)； </p><p>　　Mouse IFN-gamma ELISA試劑盒 (Cat: 39-8311-60)；</p><p>　　Mouse IL- 1βELISA試劑盒 (Cat: 88-7013-22)；</p><p>　　Mouse IL-2 ELISA試劑盒 (Cat

62、: 88-7024-22)；</p><p>　　Mouse IL-4 ELISA試劑盒 (Cat: 88-7044-77)；</p><p>　　Mouse IL-6 ELISA試劑盒 (Cat: 88-7064-77)；</p><p>　　Mouse IL-10 ELISA試劑盒 (Cat: 88-7104-88)；</p><p>　

63、　Mouse IL-23 ELISA試劑盒 (Cat: 88-7234-88)；</p><p>　　Mouse IL-17AF ELISA試劑盒 (Cat: 88-8350-77)；</p><p>　　以上所有ELISA試劑盒均購于美國的eBioscience 公司。</p><p>　　DEPC和紅細胞裂解液 購于北京拜爾迪診斷技術(shù)有限公司。</p>

64、;<p>　　細胞固定破膜劑（Foxp3 Fix/Prem buffer, Cat: 421403）購于美國Biolegend公司。</p><p>　　RPMI-1640培養(yǎng)液購自GIBCO公司。</p><p>　　胎牛血清（FBS）購自四季青生物工程公司。</p><p>　　2.2 培養(yǎng)基及溶液</p><p>　　RP

65、MI-1640培養(yǎng)基：每100 mL培養(yǎng)基中加入20%的胎牛血清。</p><p><b>　　完全培養(yǎng)基：</b></p><p>　　RPMI-1640培養(yǎng)液 100mL</p><p>　　胎牛血清 2mL</p><p>　　雙抗(PS)

66、 1 mL</p><p>　　1×PBS(0.01mol/L)：</p><p>　　Na2HPO4.12H2O3.17 g</p><p>　　NaCl8.0 g</p><p>　　KCl0.2 g </p><p>　　KH2PO40.2 g</

67、p><p>　　去離子水 900 mL，</p><p>　　放入量筒中溶解后，用去離子水定容至1000 mL，高壓滅菌，4℃貯存。 </p><p>　　洗液（Wash buffer）：100 mL 1×PBS加入5 mL 的Tween-20。 </p><p>　　Staining

68、 buffer： </p><p>　　1×PBS 1000 mL</p><p>　　Na2EDTA 5 g</p><p>　　FBS 10 mL </p><p>　　然后用0.2

69、2 μm濾膜加壓過濾后4℃貯存。</p><p>　　0.1%DEPC水：</p><p>　　1 mL DEPC原液，加1000 mL的雙蒸水，靜置24h后，4℃貯存。</p><p>　　終止液（stop solution）：2N H2SO4</p><p><b>　　2.3 其它</b></p>&

70、lt;p>　　ELISA板子購自Biolegend； 24孔細胞培養(yǎng)板購自Costar公司；流式管和70 μm尼龍膜購自美國BD Bioscience公司；十二水合磷酸氫二鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、氯化鈉、多聚甲醛等試劑均購自上海生工生物有限公司。</p><p>　　3．主要實驗儀器設(shè)備</p><p><b>　　實 驗 方 法</b></p>

71、<p>　　1．實驗動物分組和處理方法</p><p>　　64只Balb/c小鼠隨機分為正常對照組和4w、6w、8w、10w、12w、16w、20w、24w感染組（模型組），正常對照組24只每組3只，各感染時間點每組為5只。采用尾蚴腹部敷帖法感染小鼠，23±2條/每鼠，持續(xù)15min，建立日本血吸蟲病小鼠模型。分別于感染第4w、6w、8w、10w、12w、16w、20w、24w等時間點行麻醉

72、術(shù)，再處死小鼠，然后在無菌環(huán)境下取小鼠的眼球采血，并取小鼠的肝臟和脾臟備用。</p><p>　　2. 肝臟組織切片HE染色</p><p>　　(1) 無菌環(huán)境下取Balb/c小鼠肝組織；</p><p>　　(2) 將肝臟切片浸入甲醇固定1-2分鐘，蘇木素染色3分鐘，蒸餾水沖洗；</p><p>　　(3) 1 %鹽酸酒精分化5秒后置入

73、淡氨水返藍5分鐘，伊紅中染1分鐘，蒸餾水沖洗；</p><p>　　(4) 放入75%、80%、90%、100%梯度酒精脫水；</p><p>　　(5) 二甲苯透明，中性樹膠封片。</p><p>　　3．肝臟組織切片Masson染色</p><p>　?。?）將肝臟石蠟切片脫水；</p><p>　　（2）放入苦味

74、酸液中分化1 h，蘇木精液中染核20 min，雙蒸水沖洗；</p><p>　　（3）放入0.5%鹽酸酒精中沖洗30 s，雙蒸水沖洗；</p><p>　　（4）麗春紅一品紅液中染色8 min；</p><p>　　（5）2%冰醋酸浸洗片刻，再用1%磷鉬酸水溶液沖洗4min；</p><p>　　（6）放入淡綠液中染色至膠原纖維呈綠色，0.2

75、%冰醋酸浸洗片刻；</p><p>　?。?）95%酒精、無水酒精中脫水2min，二甲苯透明，中性樹膠封片。</p><p>　　4．FCM檢測Th1、Th2、Th17及Treg細胞數(shù)量與比值變化</p><p>　　4.1 肝臟和脾臟組織單細胞懸液的獲取</p><p>　　4.1.1肝組織單細胞懸液的獲取：</p><

76、p>　　(1) 無菌操作取出肝臟，將肝臟剪碎，用玻璃棒研磨通過70 μm尼龍網(wǎng)，邊研磨邊加入DMEM (2%FBS，1%PS)，注意研磨時間斷性研磨，在冰上操作；</p><p>　　(2) 將研磨后的肝細胞溶液轉(zhuǎn)入無菌的50 mL離心管中，4℃，2 500 rpm離心5 min，棄上清約留0.5mL；</p><p>　　(3)加1mL的混合酶和2 mL的 DMEM蓋緊離心管放入振

77、蕩孵育箱，37℃，消化40 min；（混合酶：0.25%胰蛋白酶，0.1%Collagense-TypeⅠ，0.1%Collagense- TypeⅣ，0.1%Hyaluronidase-TypeⅤ混合）</p><p>　　(4) 加3 mL DMEM充分混勻終止消化，4℃，靜置5 min，將上清轉(zhuǎn)移至另一無菌的50 mL離心管中，然后再4℃，用2 500 rpm離心5 min，倒掉上清；</p>

78、<p>　　加20 mL PBS溶液，4℃，2 500 rpm離心5 min，倒掉上清；</p><p>　　加20 mL PBS溶液，4℃，2 500 rpm離心5 min，棄上清，加PBS定容至20 mL；</p><p>　　取另一只50 mL離心管加入10 mL Fercoll，將定容的20 mL細胞溶液沿管壁緩慢的加入盛有Fercoll的離心管中，4℃，2 000 r

79、pm離心30 min；</p><p>　　將離心管小心取出，吸取約5 mL處的云霧層液體9 mL，放入另一15 mL離心管中；</p><p>　　加入PBS定容至15 mL混勻，4℃，2 500 rpm離心7 min，棄上清；</p><p>　　用200目的尼龍網(wǎng)過濾兩次，用適量的Staining buffer溶液重懸細胞，再將細胞調(diào)整為濃度1×10

80、6/mL備用。</p><p>　　4.1.2脾組織單細胞懸液的獲?。?lt;/p><p>　　(1) 無菌操作取出脾臟，將脾臟用玻璃棒研磨通過70 μm尼龍網(wǎng)，邊研磨邊加入DMEM(2%FBS，1%PS)，注意研磨時間斷性研磨，在冰上操作；</p><p>　　(2) 將研磨后的脾細胞溶液轉(zhuǎn)入無菌的50 mL離心管中，4℃，1 700 rpm離心5 min，棄上清約留

81、0.5 mL；</p><p>　　(3) 加2 mL紅細胞裂解液(每100 µL加1 mL紅細胞裂解液）裂解5分鐘，見紅色液體變?yōu)橥该饕后w，加5 mL PBS終止裂解；</p><p>　　(4) 加PBS定容至20 mL，4℃，2 000 rpm離心5 min，棄上清；</p><p>　　(5)加20 mL PBS溶液，4℃，2 000 rpm離心5

82、 min，倒掉上清；</p><p>　　(6)加20 mL PBS溶液，4℃，2 000 rpm離心5 min，倒掉上清；</p><p>　　(7)用200目的尼龍網(wǎng)過濾兩次，用適量的Staining buffer溶液重懸細胞，再將細胞調(diào)整為濃度1×106/mL備用。</p><p>　　4.2抗體選擇和熒光染色</p><p>

83、;　　4.2.1 FCM檢測Th1和Th2細胞</p><p>　　4.2.1.1 抗體選擇</p><p>　　Th1和Th2細胞的四色熒光標記：1 μL PerCP-Cy5.5—CD3；1 μL PE—CD4；1 μL APC—IL-4；1 μL FITC—IFN-γ。</p><p>　　Th1和Th2細胞的同型對照抗體組標記：1 μL PerCP-Cy5.5

84、—CD3；1 μL PE—CD4；1 μL APC—Rat IgG2a K Isotype Control；1 μL FITC—Rat IgG2a K Isotype Control，。</p><p>　　4.2.1.2 染色方法</p><p>　?。?）取處理好肝或脾單細胞懸液100 µL染色，加入抗體1 μL PerCP-Cy5.5—CD3和1 μL PE—CD4，4℃避

85、光孵育15 min，然后加入2 mL的 PBS洗滌；1 200rpm離心5min，棄上清；</p><p>　?。?）加入1 mL的 1×Fix-Perm buffer， 4℃暗處固定破膜30 min；1 200 rpm，離心5 min，棄上清；</p><p>　?。?）加入1 mL 1×Perm buffer室溫暗處孵育15 min，1 200 rpm離心，棄上清；

86、</p><p>　?。?） 加1 mL 1×Perm buffer重懸混勻，1 200 rpm離心5 min，棄上清，留100 µL；</p><p>　　（5）加入1 μL APC—IL-4和1 μL FITC—IFN-γ抗體，避光孵育15 min；</p><p>　?。?）加1 mL 的1×Perm buffer重懸混勻，1 2

87、00 rpm離心5min，小心棄去上清，留100 μL上機檢測。</p><p>　　以CD3設(shè)門，CD4熒光以及IFN-γ熒光雙陽性細胞表示Th1細胞亞群，CD4熒光以及IL-4熒光雙陽性細胞表示Th2細胞亞群。</p><p>　　4.2.2 FCM檢測Th17細胞</p><p>　　4.2.2.1抗體選擇</p><p>　　Th17

88、細胞的四色熒光標記：1 μL PerCP-Cy5.5—CD3；1 μL APC—CD4；0.5 μL FITC—IL-17A；1 μL PE— IL-17F。</p><p>　　Th17細胞的同型對照抗體組標記：1 μL PerCP-Cy5.5—CD3；1 μL APC—CD4；0.5 μL FITC— Rat IgG2a K Isotype Control；1 μL PE—Rat IgG2a K Isoty

89、pe Control。</p><p>　　4.2.2.2染色方法</p><p>　　同4.2.1.2操作，先加入抗體1 μL PerCP-Cy5.5—CD3和1 μL APC—CD4，破膜后加入0.5 μL FITC—IL-17A和1 μL PE— IL-17F抗體。</p><p>　　以CD3設(shè)門，以CD4和IL-17A或IL-17F熒光雙陽性細胞表示Th1

90、7細胞亞群，</p><p>　　4.2.3 FCM檢測Treg細胞</p><p>　　4.2.3.1抗體選擇</p><p>　　Treg細胞的四色熒光標記：1 μL APC—CD4；1 μL PE—CD25；0.5 μL Alexa Floure 488—Foxp3。</p><p>　　Treg細胞的同型對照抗體組標記：1 μL A

91、PC—CD4；1 μL PE—CD25；0.5 μL Alexa Floure 488—Rat IgG2a K Isotype Control。</p><p>　　4.2.3.2染色方法</p><p>　　同4.2.1.2操作，先加入1 μL APC—CD4和1 μL PE—CD25抗體；破膜后加入0.5 μL Alexa Floure 488—Foxp3抗體。</p>

92、<p>　　以CD4設(shè)門，以CD25熒光和Foxp3熒光雙陽性細胞表示Treg細胞亞群。</p><p>　　5．Real-time PCR檢測肝組織中相關(guān)細胞因子mRNA水平</p><p>　　5.1 肝組織mRNA的提取</p><p>　　5.1.1 Trizol法提取肝組織mRNA

93、 </p><p>　　(1) 將肝臟組織放入用研缽（DEPC水浸泡過）內(nèi)，加Trizol試劑1 mL，將臟研磨至無可見顆粒，再將其轉(zhuǎn)入1.5 mL無酶 EP管中混勻，靜置 5 min~10 min；</p><p>　　(2) 加入冷氯仿200 μL，劇烈震蕩15 s ，4℃，13 000 rpm離心15 min；</p><p>　　(3) 將上層的水

94、相轉(zhuǎn)入另一只無酶的EP管中，再加入500 µL異丙醇，放置10 min，用13 000 rpm離心10 min，棄上清；</p><p>　　(4)加入冷的75%酒精1 mL，混勻后4℃，13 000 rpm離心5 min；</p><p>　　(5)棄上清，室溫干燥10 min；</p><p>　　(6)加入DEPC水20 µL，混勻，點離，

95、取4 µL檢測提取的mRNA純度和濃度，其余放入-20℃保存待用。</p><p>　　5.1.2 mRNA的純度和濃度檢測</p><p>　　(1)取4 µL樣品，加DEPC水396 µL；</p><p>　　(2)取DEPC水400 µL放入比色杯，對照歸零；</p><p>　　(3)記錄A2

96、80nm和A260nm的吸光度，計算OD260/OD280值；</p><p>　　(4)把A260nm的吸光度的值換算成濃度：單鏈RNA濃度（µg/µL）= OD260×稀釋倍數(shù)×0.04。</p><p>　　5.2逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)（Reverse Transcription-PCR，RT-PCR）</p><p>　

97、　（1）每20 μL反應(yīng)體系加總RNA量必須大于等于2 µg；</p><p>　?。?）在無RNA酶的操作室進行，冰上加樣，反應(yīng)體系如下：</p><p>　　（3）使用梯度PCR儀上進行反轉(zhuǎn)錄，條件如下：</p><p>　　（4）反應(yīng)結(jié)束后，將cDNA溶液放置4度保存待用，如果要長期保存需放入-20度保存。</p><p>　

98、　5.3熒光實時定量PCR（Real-time PCR）</p><p>　　5.3.1引物的設(shè)計與合成</p><p>　　根據(jù)GenBank中小鼠IL-2、IFN-γ、IL-12、IL-4、IL-10、IL-6、IL-23、IL-17、ROR-γt、Foxp3、TGF-β及IL-1β的cDNA序列為模板，用Primer 軟件輔助設(shè)計引物。委托Invitrogen公司合成。</p&

99、gt;<p>　　The Primers used for Real-time PCR analysis</p><p>　　5.3.2 Real-time PCR反應(yīng)體系（反應(yīng)體積20μL）：</p><p>　　5.3.3使用美國Bio-RAD公司Real-time PCR儀進行反應(yīng)，反應(yīng)條件如下：</p><p>　　5.3.4 實驗結(jié)果分析&l

100、t;/p><p>　　RT-PCR的計算方法：CT值來確定PCR產(chǎn)物定量，目的基因基因表達量=2-△△CT。其中△CT值由樣本CT值減去相應(yīng)β-actin的CT值，△△CT值為日本血吸蟲感染組小鼠樣本平均△CT值減去正常組小鼠樣本平均△CT值。</p><p>　　6．ELISA檢測小鼠血清相關(guān)細胞因子水平</p><p>　　ELISA檢測小鼠血清中IL-2、IFN-

101、γ、IL-4、IL-10、IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β及IL-1β水平。</p><p>　　(1) 先將ELISA試劑盒和ELISA板平衡至室溫；</p><p>　　(2) 使用無菌雙蒸水將抗體包被液稀釋為1×，包被96孔ELISA板，每孔加100 µL，4℃孵育過夜；</p><p>　　(3) 棄去包被液，用300

102、1;L Wash Buffer 洗板5次，每次洗滌1 min，棄洗滌液，并在吸水紙上拍干； </p><p>　　(4) 將檢測稀釋液稀釋為1×Assay Diluent，每孔加200 µL，室溫避光孵育1 h；</p><p>　　(5) 棄去檢測稀釋液，用300 µL洗液洗板5次，每次洗滌1 min，在吸水紙上拍干；</p><p>

103、;　　(6) 按照eBioscience提供的ELISA試劑盒說明書稀釋標準品。</p><p>　　(7) 加100 µL標準品到對應(yīng)的孔中，再加100 µL樣品到對應(yīng)的孔中，封板，室溫避光孵育2 h，設(shè)空白對照孔2-3個；</p><p>　　(8) 棄去樣品液，重復(fù)步驟（5）；</p><p>　　(9) 每孔加100 µL檢測抗

104、體，封板，室溫避光孵育1 h；</p><p>　　(10) 棄去抗體液，重復(fù)步驟（5）；</p><p>　　(11) 每孔加100 µL HRP溶液，封板，室溫避光孵育30min；</p><p>　　(12) 棄板中液體，每孔加250 µL Wash buffer靜置2min，棄去，吸水紙上拍干，重復(fù)7次；</p><p

105、>　　(13) 每孔加100 µL TMB底物，封板，室溫避光孵育15min；</p><p>　　(14) 每孔加50 µL 終止液終止反應(yīng)；</p><p>　　(15) 用酶標儀測波長450nm的OD值；</p><p>　　(16) 標準曲線按照eBioscience公司提供的ELISA試劑盒的說明書繪制，并根據(jù)標準曲線，計算出相對

106、應(yīng)的濃度。</p><p><b>　　7. 統(tǒng)計學(xué)處理</b></p><p>　　使用Graphpad Prism 5.0軟件進行分析，本實驗中實驗數(shù)據(jù)結(jié)果用均數(shù)±標準差（±S）表示，各感染組與正常對照組之間的比較進行單向方差分析，“*”表示 P＜0.05，即認為有統(tǒng)計學(xué)意義；“**”表示 P＜0.01，即有顯著性差異。</p>

107、<p><b>　　實 驗 結(jié) 果</b></p><p>　　1. 肝組織病理變化檢測</p><p>　　1.1肉眼觀察小鼠肝、脾病理變化</p><p>　　肝臟：正常Balb/c小鼠的肝臟呈肉紅色，大小形態(tài)正常且邊緣整齊，質(zhì)地柔軟，表面光滑；感染第4w，小鼠肝臟腫大，顏色略暗淡，為深紅色，邊緣變鈍，質(zhì)地略韌；感染第6w，小鼠肝

108、臟明顯腫大，顏色呈深褐色，質(zhì)地變硬，表面開始有蟲卵顆粒狀結(jié)節(jié)出現(xiàn)；感染第8w，肝臟體積明顯增大，顏色呈深褐色、質(zhì)地硬，表面有散在的蟲卵顆粒狀結(jié)節(jié)；感染第10w，肝臟體積明顯增大，顏色呈深褐色，質(zhì)地硬，表面布滿了大小不一的蟲卵顆粒狀結(jié)節(jié)；感染第12w，小鼠肝臟體積明顯增大，顏色呈深褐色或黑褐色，質(zhì)地硬，邊緣不整齊，表面蟲卵顆粒狀結(jié)節(jié)顯著性增加；感染第16w，肝臟體積明顯增大，顏色呈黑色，邊緣不整齊，質(zhì)地硬，表面有大量的蟲卵顆粒狀結(jié)節(jié)；感染

109、第20w，肝臟體積縮小，顏色呈黑色，邊緣不整齊，質(zhì)地硬，表面布滿顆粒狀結(jié)節(jié)；感染第24w，肝臟體積明顯縮小，顏色呈黑色，邊緣不整齊，質(zhì)地硬，表面布滿顆粒狀結(jié)節(jié)。</p><p>　　脾臟：正常Balb/c小鼠脾臟正常大小約1.8cm，為扁橢圓形，顏色為鮮紅色，表面光滑，質(zhì)地軟而脆；感染第4w，小鼠脾臟略微腫大，為扁橢圓形，顏色為暗紅色，質(zhì)地軟而脆；感染第6w，小鼠脾臟腫大，為扁橢圓形，顏色為深暗紅色，質(zhì)軟而脆；感

110、染第8w，小鼠脾臟明顯腫大，變?yōu)闄E圓形且變粗，顏色變?yōu)榧t褐色，質(zhì)地變韌；感染第10w，小鼠脾臟顯著性腫大且變?yōu)闄E圓形且變粗，顏色為紅褐色，質(zhì)地韌；感染第12w，小鼠脾臟腫大為橢圓形且變粗，顏色呈深褐色，質(zhì)地硬；感染第16w，小鼠脾臟腫大呈橢圓形且變粗，顏色為黑色，質(zhì)地硬；感染第20w，小鼠脾臟體積減小，顏色呈黑色，質(zhì)地硬，；感染第24w，小鼠脾臟體積明顯減小，顏色為黑色，質(zhì)地硬。</p><p>　　1.2 HE