二種大豆LEA4蛋白的金融離子結(jié)合特性及對生物大分子的保護作用.pdf

1、LEA（late embroygenesis abundant）蛋白的表達與植物細胞抗逆保護作用有著密切聯(lián)系。LEA蛋白不僅在植物發(fā)育晚期的種子中大量積累，在受到水分脅迫（干旱、鹽、低溫等）的營養(yǎng)組織中，LEA蛋白也可被誘導表達。因此，LEA蛋白的表達與植物細胞抗逆保護作用有著密切聯(lián)系。根據(jù)LEA蛋白序列的保守性和一些特殊的基元序列可將其分為七組。目前對LEA1～3蛋白的保護功能的研究已積累了較多資料:如LEA基因的表達模式、細胞學定位

2、、轉(zhuǎn)基因植物研究、蛋白質(zhì)特性分析等。然而，與上述的LEA蛋白相比較，對LEA4蛋白的研究相對較少，其功能和作用機制仍然不清楚。
　　大豆GmPM1和GmPM9蛋白屬于LEA4蛋白。經(jīng)蛋白質(zhì)序列比較，可知GmPM1和GmPM9蛋白高度同源，后者與前者相比有23個氨基酸的缺失。GmPM1和GmPM9蛋白還含有高比例的組氨酸，分別為5.8％和4.6％。因此，推測它們可能具有結(jié)合金屬離子的能力。
　　從大豆“白農(nóng)6號”未成熟種子的c

3、DNA中擴增出GmPM1和GmPM9全長基因序列，它們可分別編碼(—)173和152氨基酸的蛋白質(zhì)。將這兩個基因克隆至pET28a大腸桿菌表達載體后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 Star獲得BL/GmPM1和BL/GmPM9菌株。經(jīng)誘導表達再經(jīng)親和層析獲得純化的GmPM1和GmPM9蛋白。通過固相金屬螯合親和層析（immobilized metalion affinity chromatography，IMAC）確定GmPM1和GmPM9蛋

4、白可與Fe3+，Ni2+，Cu2+或Zn2+相結(jié)合，而不與Ca2+，Mg2+，Mn2+結(jié)合。再通過等溫熱量滴定實驗對GmPM1和GmPM9蛋白的金屬離子結(jié)合能力進行了定量研究。結(jié)果表明GmPM1和GmPM9蛋白均具有較強Fe3+結(jié)合能力(K＞105)，但GmPM1比GmPM9蛋白具有更強的Fe3+離子結(jié)合力。GmPM1和GmPM9蛋白與Fe3+結(jié)合后，二級結(jié)構(gòu)并未發(fā)生變化。
　　為了研究LEA4蛋白是否具有抗氧化功能，采用2-脫氧

5、核糖降解法檢測GmPM1和GmPM9蛋白是否可以減弱Fe3+參與的Fenton反應。結(jié)果顯示，在特異性實驗中，在0mM或100mM NaCl情況下，GmPM1和GmPM9蛋白均具有抗氧化能力。GmPM1蛋白的抗氧化能力與BSA（哺乳動物血液中一類具有較強抗氧化能力的蛋白）相似，而GmPM9蛋白的抗氧化能力只相當于甘露醇（只在較高濃度起作用，IC50＞1mg.ml-1）的活性。但是在非特異性實驗中，GmPM1和GmPM9蛋白均不再具有抗氧

6、化能力。這說明，GmPM1和GmPM9蛋白可以通過結(jié)合Fe3+，減少羥基自由基的形成，從而降低2-脫氧核糖降解，行使其抗氧化功能。有理由推測，在水分脅迫時，LEA4蛋白可能通過結(jié)合金屬離子，從而降低植物體內(nèi)的過氧化傷害和離子毒害。
　　ITC實驗證實，GmPM1和GmPM9蛋白與Zn2+或Ni2+結(jié)合能力較弱(K＜105)。GmPM1蛋白與Cu2+結(jié)合能力較強(K＞105)。通過比較ITC所獲得的結(jié)合常數(shù)后發(fā)現(xiàn)，GmPM1蛋白比G

7、mPM9蛋白具有更強的Zn2+離子結(jié)合力，但兩者對Ni2+的結(jié)合力相近。GmPM1和GmPM9蛋白與Cu2+或Zn2+結(jié)合后，二級結(jié)構(gòu)并未發(fā)生變化。
　　進一步研究了LEA4蛋白對乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)和TubulinDNA的保護作用。結(jié)果表明，GmPM1和GmPM9蛋白可保護凍融條件下的LDH酶活。在待測蛋白與LDH摩爾濃度比為10∶1時，GmPM1和GmPM9的保護作用相近，LDH酶活