基于食品蛋白和天然多糖的生物大分子自組裝.pdf

1、自組裝是指分子或者分子的一部分自發(fā)地形成有序結(jié)構(gòu)的過程。經(jīng)過多年的發(fā)展，自組裝已經(jīng)在眾多的合成高分子體系中取得成功?，F(xiàn)在有越來越多的研究開始利用生物高分子在體外進(jìn)行組裝。生物高分子可以利用特有的相互作用如蛋白質(zhì)的特異性相互作用、DNA的堿基互補(bǔ)等進(jìn)行組裝。在眾多的生物高分子組裝體系中，沒有特異性相互作用的球狀蛋白之間的組裝較少有文獻(xiàn)涉及。雖然現(xiàn)在已經(jīng)有利用單一的球狀蛋白在特定的變性條件下通過靜電相互作用和疏水相互作用得到纖維狀組裝體的報(bào)

2、道，也有利用交聯(lián)劑制備蛋白質(zhì)微球的報(bào)道，但限于操控天然球狀蛋白分子之間的非共價(jià)鍵相互作用的復(fù)雜性，到目前為止，還沒有見到利用天然的、沒有特異性相互作用的球狀蛋白分子自組裝制備納米凝膠的報(bào)道。蛋白質(zhì)，尤其是食品中的蛋白質(zhì)，本身是一類營養(yǎng)物質(zhì)，無毒，可以食用，具有良好的生物相容性，在消化系統(tǒng)內(nèi)可以被降解，很適合于作為口服藥物載體。因此，利用食品蛋白質(zhì)進(jìn)行自組裝，不僅具有研究價(jià)值，而且具有應(yīng)用前景。 本論文的工作主要集中在利用天然高

3、分子，包括球狀和鏈狀的食品蛋白質(zhì)、天然的帶電荷和不帶電荷的多糖進(jìn)行自組裝，得到生物大分子膠束或者生物大分子微凝膠。文中首次提出了一種方便的利用一對(duì)帶相反電荷的蛋白質(zhì)，或者利用帶相反電荷的蛋白質(zhì)和多糖進(jìn)行組裝制備微凝膠的方法，并在多個(gè)體系中取得成功。我們所實(shí)現(xiàn)的上述生物大分子組裝，與線性合成高分子的自組裝，以及傳統(tǒng)的利用蛋白質(zhì)之間的特異性相互作用引起的組裝均有很大的不同。我們所發(fā)展的利用食品蛋白質(zhì)和天然多糖制備微凝膠的方法簡單易行，除pH

4、調(diào)節(jié)所需要的酸和堿以外，在制備過程中不加入其他化學(xué)物質(zhì)，因而所得到的微凝膠無毒、生物相容、可生物降解、可以食用，適合于作為藥物載體。具體來說，本論文包括了以下三個(gè)部分的工作： 第一部分是利用兩種等電點(diǎn)不同的食品蛋白質(zhì)通過加熱變性進(jìn)行自組裝制備納米微凝膠。白蛋白和溶菌酶都是雞蛋清中的蛋白質(zhì)，其中，白蛋白的等電點(diǎn)在4．8而溶菌酶的等電點(diǎn)在10．7。我們發(fā)展的方法如下：在弱酸性溶液中混合這兩種蛋白質(zhì)，此時(shí)二者的相互作用不是很強(qiáng)；然后

5、調(diào)節(jié)溶液pH到溶菌酶的等電點(diǎn)附近，在這過程中，二者先是形成靜電絡(luò)合物，接著靜電絡(luò)合物發(fā)生分子重排，溶菌酶分子因?yàn)槠潇o電荷趨于零而傾向丁聚集，白蛋白分子因?yàn)閹в休^多的負(fù)電荷而傾向于互相遠(yuǎn)離；再加熱溶液，使兩種蛋白質(zhì)變性以形成分子問的疏水作用和二硫鍵，即可得到穩(wěn)定的納米粒子。文中我們對(duì)這兩種蛋白質(zhì)通過加熱變性進(jìn)行自組裝的條件進(jìn)行了詳細(xì)的研究，找到了最佳的制備條件。并用AFM和TEM觀察了所制備的納米粒子的形貌。結(jié)合球狀蛋白自身的性質(zhì)和光散射

6、研究的結(jié)果我們判斷出所制備的球形納米粒子是一種微相水凝膠，即球狀蛋白的微凝膠。然后，我們又用<電位、離心超濾分離、聚丙烯酰胺凝膠電泳等方法確定了凝膠粒子的核殼結(jié)構(gòu)，其核是由變性的溶菌酶分子和一小部分變性的白蛋白分子所構(gòu)成，而殼層則主要由變性的白蛋白分子構(gòu)成。所形成的凝膠粒子能可逆、穩(wěn)定地分散在pH小于4和大于6．3的溶液中。而在白蛋白的等電點(diǎn)附近，由于凝膠粒子表面所帶的電荷趨于零而形成二次聚集體。為了解決此問題，我們用安全、無毒、在自然

7、界中自然發(fā)生的Maillard反應(yīng)，將葡聚糖的末端羥基與白蛋白分子表面的賴氨酸進(jìn)行偶聯(lián)，然后將接有葡聚糖的白蛋白與溶菌酶進(jìn)行組裝，得到了在白蛋白等電點(diǎn)也能穩(wěn)定分散的納米凝膠。根據(jù)對(duì)以上自組裝形成納米凝膠機(jī)理的理解，我們發(fā)展了一種通用的利用一對(duì)帶相反電荷的蛋白質(zhì)進(jìn)行組裝制備微凝膠的方法，并在多個(gè)體系中取得成功。 第二部分是利用殼聚糖和白蛋白制備pH敏感的納米水凝膠。在前一個(gè)體系成功的基礎(chǔ)上，我們選擇了在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛的殼聚

8、糖和白蛋白分子進(jìn)行組裝。殼聚糖是唯一一種天然的陽離子型多糖，具有抗菌、生物相容、抗腫瘤等多種作用，在酸性條件下可以質(zhì)子化而溶于水。將殼聚糖和白蛋白在酸性溶液以適當(dāng)?shù)谋壤旌虾蟛⒄{(diào)節(jié)混合溶液的pH到適當(dāng)值，然后加熱使白蛋白變性即可得到穩(wěn)定的凝膠粒子。我們對(duì)制備條件進(jìn)行了較為詳細(xì)地探討，得到了優(yōu)化的制備方案。SEM和TEM觀察表明凝膠粒子具有一定的核殼結(jié)構(gòu)。通過對(duì)凝膠粒子(電位的研究，并結(jié)合凝膠粒子的溶解性質(zhì)，我們認(rèn)為凝膠粒子的外層是由伸展

9、的殼聚糖鏈所構(gòu)成，而白蛋白和被凍結(jié)在白蛋白微凝膠網(wǎng)絡(luò)中的殼聚糖鏈，共同構(gòu)成了凝膠粒子的內(nèi)核。通過動(dòng)態(tài)光散射的研究，我們發(fā)現(xiàn)所制備的微凝膠粒徑由于凝膠粒子電荷的變化而具有pH敏感性。最后，以芘作為疏水熒光探針，我們發(fā)現(xiàn)所制備的凝膠粒子在不同的pH環(huán)境下具有不同的親／疏水性。 第三部分是利用葡聚糖接枝的β-．酪蛋白實(shí)現(xiàn)了對(duì)活性物質(zhì)溶菌酶分子的包埋和釋放，發(fā)現(xiàn)釋放出的溶菌酶分子完全保留了其生物活性。β-酪蛋白是牛奶蛋白中的一種組分，

10、是一種線性的蛋白質(zhì)分子，等電點(diǎn)是pH4．8。通過Maillard反應(yīng)將分子量35kDa的葡聚糖分子接枝到B．酪蛋白上制備了全水溶性的接枝聚合物。當(dāng)把溶菌酶的水溶液滴加到上述接枝共聚物的水溶液中，并調(diào)節(jié)溶液的pH至某一合適值，即可得到以B一酪蛋白和溶菌酶的靜電絡(luò)合物為核、酪蛋白上接枝的葡聚糖為殼的膠束。在一定的酸、堿或鹽的條件下，溶菌酶還可以從膠束中釋放出來。對(duì)微球菌裂解的實(shí)驗(yàn)表明釋放出的溶菌酶分子具有和單獨(dú)的溶菌酶分子相同的活性。我們還