蘋果枝干輪紋病抗病性狀分子標記及幾丁質酶基因克隆研究.pdf

1、蘋果(MalusdomesticaBorkh.)枝干輪紋病是目前我國蘋果生產(chǎn)上危害嚴重、發(fā)生普遍的病害之一，在我國北方蘋果產(chǎn)區(qū)，特別是山東地區(qū)普遍發(fā)生，并有逐漸加重的趨勢。傳統(tǒng)的雜交育種方法，周期較長，然而，通過DNA分子技術，尋找與高抗病性狀緊密連鎖的DNA分子標記，作為雜交育種后代輔助選擇的工具，可以加速常規(guī)抗病育種進程。另外，蘋果枝干輪紋病是由輪紋病菌（Botryosphaeriaberengerianaf.sp.piricola

2、）侵染枝干而引起的，幾丁質酶是一種由單基因編碼的降解幾丁質的糖苷酶，可以降解真菌細胞壁的主要成分幾丁質，從而抑制真菌的生長與繁殖，因此幾丁質酶基因在植物的抗病育種中有重要的研究價值。
　　 本研究以蘋果品種‘舞姿’(Telamon)ב短枝富士’（SpurFuji）的15a生雜交后代群體104株植株為試材，根據(jù)田間發(fā)病情況的調(diào)查結果，采用集群分類法(Bulkedsegregantanalysis，BSA)對蘋果枝干輪紋病抗病性狀

3、進行了SSR(Simplesequencerepeat)分子標記研究。同時，利用同源克隆和RACE方法從蘋果莖尖中克隆到蘋果幾丁質酶基因的全長序列，并對該基因進行生物信息學分析及組織表達研究。獲得的研究結果如下:
　　 1.通過對來自蘋果、梨基因組的共289對SSR引物的篩選，獲得了2個與控制枝干輪紋病抗病性狀相關的SSR標記:Hi02a09和Hi04g11。從而可以推測在蘋果公共遺傳圖譜的第11連鎖群上存在與抗病性狀相關的主效

4、基因。
　　 2.從蘋果莖尖中克隆到幾丁質酶基因的cDNA全長序列，命名為MdChi(GenBank登錄號:HQ416905)。其長度為1158bp，包括完整的開放閱讀框954bp，編碼317個氨基酸，等電點為8.30，推斷分子量為33.8388KDa，分子式為:C1485H2263N413O460S18.該序列所編碼的蛋白屬于糖苷水解酶19家族的幾丁質酶，與黃冠梨PyChi1核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分別為87.96％和9

5、5.27％。
　　 3.根據(jù)獲得的MdChi的cDNA序列，設計特異引物，擴增MdChi基因的gDNA全長序列，同時利用Spidey程序分析其對應的外顯子和內(nèi)含子。結果表明蘋果MdChi的gDNA全長為2515bp，含有3個外顯子和2個內(nèi)含子。
　　 4.運用生物信息學方法，對蘋果MdChi的核苷酸及編碼的氨基酸序列進行分析。結果顯示:MdChi編碼的幾丁質酶的二級結構是由大量的α-螺旋、無規(guī)則卷曲和少量的擴展鏈結構組成

6、;該幾丁質酶屬于幾丁質酶19家族，具有幾丁質酶19家族顯著的結構域:羧基端的幾丁質結合域和氨基端的糖苷水解酶19家族的保守域;利用同源模型構建了MdChi的空間三維結構;同源性分析表明，MdChi與已報道的其它植物的幾丁質酶基因編碼的氨基酸序列具有較高的同源性。
　　 5.利用real-timePCR定量檢測輪紋病菌不同侵染時期蘋果莖尖中MdChi的表達狀況，發(fā)現(xiàn)感病個體中該基因在不同時期的表達量均較高?？梢酝茰y，在發(fā)病個體上，