圍產(chǎn)期奶牛外周血液學及免疫相關細胞因子和TLR-4基因表達規(guī)律的研究.pdf

1、圍產(chǎn)期是奶牛管理上的一個重要階段，其管理水平直接影響到產(chǎn)后的繁殖和泌乳性能。奶牛圍產(chǎn)期外周血白細胞功能發(fā)生一定程度的紊亂，其主要表現(xiàn)為淋巴細胞、中性粒細胞免疫功能減弱。目前對該階段的研究主要集中在能量負平衡以及飼料添加劑等方面，而對于該階段奶牛機體血液學指標及機體免疫力相關基因表達研究國內(nèi)還存在空白，尤其是圍產(chǎn)期階段淋巴細胞、中性粒細胞相關調(diào)節(jié)基因表達的研究還未見報道。在分析和綜述了先前研究的基礎上，本研究以產(chǎn)前21天、14天、7天、產(chǎn)

2、犢當天0天、產(chǎn)后7天、14天和21天7個時間點的外周血淋巴細胞、中性粒細胞為研究對象，通過RT-PCR、FCM和WB等手段對調(diào)節(jié)外周血中性粒細胞(PMN) TLR-4通路(TLR-4，CD14，MD-2)基因、淋巴細胞中CD3+、CD4+、CD8+及IL-2和IL-4細胞因子的表達來進行了研究，以期通過闡明圍產(chǎn)期外周血中淋巴細胞、中性粒細胞及機體免疫力相關基因的表達規(guī)律，為以后改善該階段奶牛的免疫狀況提供理論基礎和科學依據(jù)。
　　

3、 主要研究結果如下:
　　 1奶牛圍產(chǎn)期血液學的研究
　　 通過對外周血中各種細胞數(shù)量以及血漿中GPT，GOT和GSH-Px酶的活性分析表明:白細胞總數(shù)在產(chǎn)前7天，14天顯著低于其它組(P＜0.05）;淋巴細胞從產(chǎn)前21天（3.34±0.13×109）/L逐漸降低至產(chǎn)后7天（2.41±0.13×109）/L，隨后又逐漸升高;相對于吞噬細胞和中性粒細胞在產(chǎn)犢期達到（1.45±0.02×109）/L和（3.12±0.26×

4、109）/L峰值，而嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞在產(chǎn)犢時卻僅為（0.13±0.06×109）/L和（0.05±0.03×109）/L，為7組中的最低值。
　　 從測定的結果可以看出，產(chǎn)前外周血紅細胞數(shù)量逐漸增加，產(chǎn)犢日達到峰值(6.04±1.02×1012)/L后逐漸降低，產(chǎn)前與產(chǎn)后差異顯著(p＜0.05)。血紅蛋白的含量在產(chǎn)前21天逐漸升高，產(chǎn)犢時達到最高水平，產(chǎn)后較低。血小板在產(chǎn)前21天逐漸增加，產(chǎn)犢后迅速降到最低值，之后逐漸

5、升高。
　　 血漿中酶活性分析表明，除GPT在圍產(chǎn)期差異不顯著（P＞0.05）外，GOT和GSH-Px兩種酶的活性在一定時期內(nèi)存在顯著差異，特別是反映氧化應激的GSH-Px其產(chǎn)后第7天時達到峰值，極顯著高于其它組(P＜0.01)。
　　 2圍產(chǎn)期外周血T淋巴細胞亞群及細胞因子表達的研究
　　 通過應用流式細胞術測定CD3+、CD4+、CD8+及實時熒光定量(RT-PCR)檢測細胞因子IL-2，IL-4 mRNA表

6、達分析表明:血液中CD3+的比例在產(chǎn)前21天內(nèi)占（50.8±4.61％），產(chǎn)后14天內(nèi)降低到（33.3±3.53％），兩者差異極顯著（P＜0.01）;CD4+在產(chǎn)前21天內(nèi)保持較高水平（21.38±0.65％），產(chǎn)后21天內(nèi)維持在較低水平（6.89±0.32％），與產(chǎn)前差異極顯著(P＜0.01); CD8+的比例在產(chǎn)犢時達到最高水平（16.91±2.02％），差異顯著（P＜0.05）;而與機體免疫力直接相關的CD4+/CD8+的比值呈現(xiàn)

7、產(chǎn)前高而產(chǎn)后低的趨勢，產(chǎn)前CD4+/CD8+＞1，產(chǎn)后CD4+/CD8+＜1。IL-2 mRNA的表達量在產(chǎn)后0～14天內(nèi)下調(diào)，之后上升。IL-4mRNA的表達量產(chǎn)犢期達到最高隨后下降，至第7天降至最低。
　　 3圍產(chǎn)期血液PMN中TLR-4途徑mRNA表達量的研究
　　 TLR-4途徑(TLR-4、CD14、MD-2)是調(diào)節(jié)PMN識別病原菌的主要通路。該通路上基因表達的趨勢直接反映機體的免疫狀態(tài)。本研究應用RT-PCR

8、分析了圍產(chǎn)期外周血PMN細胞中TLR-4途徑(TLR-4、CD14、MD-2)的mRNA表達，結果發(fā)現(xiàn):PMN中TLR-4途徑基因(TLR-4，CD14，MD-2)中，TLR-4和CD14在產(chǎn)后14天內(nèi)mRNA的表達量下調(diào)，而MD-2僅在產(chǎn)后7天下調(diào)。
　　 4圍產(chǎn)期TLR-4蛋白的表達量分析
　　 為進一步研究圍產(chǎn)期間TLR-4的變化，我們主要應用變性聚丙烯酰胺和Western Blot技術分別檢測了PMN中總蛋白和影

9、響PMN關鍵基因的TLR-4蛋白質(zhì)的表達情況，研究發(fā)現(xiàn):(1)血液PMN中總蛋白含量在不同階段差異不顯著（P＞0.05），可能與維持細胞活性的主要蛋白表達恒定有關，所表達的蛋白分子量在55～70 KDa之間占據(jù)表達優(yōu)勢。(2)產(chǎn)后14天內(nèi)TLR-4蛋白表達顯著降低。
　　 通過以上研究我們可以得出以下結論:
　　 1奶牛圍產(chǎn)期階段外周血中白細胞數(shù)量（淋巴細胞、中性粒細胞、吞噬細胞等）及GOT、GSH-Px酶活性存在一定程

10、度的變化;
　　 2淋巴細胞的T細胞亞群CD3+、CD4+、CD8+的數(shù)量和比例發(fā)生變化，尤其是產(chǎn)后CD4+/CD8+的比例較低，CD4+/CD8+＜1。
　　 3外周血中淋巴細胞中IL-2、IL-4的mRNA表達量發(fā)生改變。其中IL-2在產(chǎn)后14天內(nèi)下調(diào)差異極顯著，IL-4在產(chǎn)后7天下調(diào)差異極顯著。
　　 4調(diào)節(jié)PMN紊亂的TLR-4途徑基因(TLR-4，CD14，MD-2) mRNA表達量在產(chǎn)后一定時間內(nèi)下調(diào)