蘇云金芽胞桿菌菌株YBT-1520中Zwittermicin A的生物合成調(diào)控研究.pdf

1、Zwittermicin A(ZmA)是一種聚酮-非核糖體肽雜合的物質(zhì)，它由一些芽胞桿菌所產(chǎn)生，包括蠟狀芽胞桿菌菌株UW85和蘇云金芽胞桿菌菌株YBT-1520。ZmA一方面具有抗生素廣譜的抑菌活性，一方面對蘇云金芽胞桿菌的晶體蛋白有殺蟲增效活性。其特殊的分子結(jié)構(gòu)和多樣的生物活性，使得我們有興趣對其開展合成基因簇的鑒定及調(diào)控機(jī)制的研究。
　　 國外的研究團(tuán)隊通過對菌株UW85中與ZmA合成相關(guān)的非核糖體肽酶(nonribosom

2、al peptide synthetase，NRPS)和聚酮合酶(polyketide synthase，PKS)功能域的分析，推測了ZmA的合成途徑，但是并沒有給出直接的實驗證據(jù)，也沒有表明基因簇的完整性。
　　 在本研究中，我們期望通過異源表達(dá)的方式來鑒定ZmA完整的合成基因簇。為此，我們構(gòu)建了菌株YBT-1520的全基因組細(xì)菌人工染色體(BAC)文庫。文庫包含1200個克隆子，平均插入片段大小為45 Kb，文庫約覆蓋總基因

3、組10倍。以已知與ZmA合成相關(guān)的基因設(shè)計引物為探針，通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)到文庫中經(jīng)行篩選，得到了9個陽性克隆。將這9個陽性克隆末端測序，結(jié)合其限制性酶切物理圖譜和菌株YBT-1520基因組測序，構(gòu)建了覆蓋ZmA合成基因簇的重疊聯(lián)合群，該重疊聯(lián)合群共覆蓋了103 Kb區(qū)域。通過本研究所構(gòu)建的在芽胞桿菌中相容的、可克隆大片段的穿梭載體pEMB0557、pEMB0603和pEMB0606，將這9個陽性克隆的插入片段組合式的導(dǎo)入不產(chǎn)Zm

4、A的蘇云金芽胞桿菌菌株BMB171中，檢測ZmA的表達(dá)。
　　 有2個BAC克隆子的插入片段(總共覆蓋約60 Kb的DNA區(qū)域)共同導(dǎo)入菌株BMB171后，可以產(chǎn)生ZmA，表明該60 Kb對于ZmA的合成是充分的。在這60 Kb區(qū)域下游，有一個之前未經(jīng)發(fā)現(xiàn)的基因簇，含有三個開放讀碼框，命名為zma WXY，將包含該基因簇和60 Kb基因簇(共約70 Kb)的2個BAC克隆子組合在BMB171中表達(dá)發(fā)現(xiàn)，ZmA的產(chǎn)量有所增加。實驗

5、證實，ZmaWXY為ZmA抗性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其可以阻止ZmA分子進(jìn)入胞內(nèi)，是不同于乙酰化酶ZmaR(早先報道的ZmA抗性基因表達(dá)蛋白)的另一種抗性機(jī)制；同時，增加抗性基因zmaWXY或zmaR的拷貝數(shù)，可以提高ZmA的產(chǎn)量。
　　 對于抗生素的產(chǎn)生菌，為了防止其被自身所產(chǎn)生的抗生素所抑制，一定存在相應(yīng)的抗性機(jī)制。早前就有研究報道指出，對于ZmA產(chǎn)生菌，將抗性基因zmaR突變后，其仍然可以產(chǎn)生ZmA，但對高濃度的ZmA變得敏感，說明一

6、定存在著其他抗性機(jī)制，但一直未知。結(jié)合我們在本研究中的發(fā)現(xiàn)，我們提出了完整的ZmA產(chǎn)生菌對ZmA抗性免疫的模式：ZmaWXY首先阻擋胞外一定濃度的ZmA進(jìn)入胞內(nèi)，當(dāng)胞外ZmA的濃度超過ZmaWXY所能發(fā)揮的功能閾值時，ZmA分子仍然可以進(jìn)入胞內(nèi)，此時就由胞內(nèi)的ZmaR發(fā)揮乙?；δ?，使ZmA分子失去抗生素活性，從而保證產(chǎn)生菌的安全。
　　 此外，我們在60 Kb基因簇內(nèi)部還發(fā)現(xiàn)了一個之前未發(fā)現(xiàn)的基因orf123，對其進(jìn)行基因缺失

7、突變后發(fā)現(xiàn)ZmA的產(chǎn)量明顯提高，推測其為潛在的ZmA合成的負(fù)調(diào)控基因。在這兩個基因簇的兩端(70 Kb)，存在推測的轉(zhuǎn)座酶基因，暗示這兩個基因簇是可移動的區(qū)域并且涵蓋ZmA完整的合成基因簇。
　　 通過本研究，我們利用異源表達(dá)手段確認(rèn)了ZmA完整的合成基因簇，指出完整的基因簇由合成、抗性免疫和調(diào)控三個部分組成；發(fā)現(xiàn)并證實了與zmaR互補(bǔ)的、新的ZmA抗性基因zma WXY，并提出了ZmA產(chǎn)生菌對ZmA完整的抗性免疫模式；揭示了潛