豬鏈球菌血清2型分子診斷技術(shù)研究及初步應(yīng)用.pdf

1、豬鏈球菌病是一種嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病，可引起豬的腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、敗血癥、心內(nèi)膜炎和中毒休克綜合征等，給養(yǎng)殖業(yè)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。豬鏈球菌是世界范圍內(nèi)引起豬鏈球菌病的最主要的病原，根據(jù)莢膜多糖可將豬鏈球菌分為35個(gè)血清型，即血清1～34型和血清1/2型。其中血清1型、2型、7型和9型對(duì)豬的致病性較強(qiáng)，尤其是豬鏈球菌血清2型，不僅對(duì)豬致死性強(qiáng)，而且能引起人的發(fā)病和死亡，在公共衛(wèi)生方面引起了極大的關(guān)注。本研究旨在建立針對(duì)豬鏈球菌的快速特

2、異的分子生物學(xué)和免疫學(xué)檢測(cè)方法，同時(shí)對(duì)河南省境內(nèi)豬群中的豬鏈球菌感染情況進(jìn)行調(diào)查，為該病的病原分子生物學(xué)研究、快速診斷和有效防制提供參考。
　　 1.豬鏈球菌血清2型河南分離株的主要毒力基因鑒定及其cps2J全基因序列分析
　　 為了解SS2河南分離株的毒力基因型及cps2J全基因突變情況，本研究設(shè)計(jì)并合成了7對(duì)擴(kuò)增SS2毒力基因gdh、cps2J、mrp、ef、sly、orf2和fbps的特異性引物，建立檢測(cè)SS2的7

3、種毒力基因的PCR方法，并對(duì)SS2的cps2J進(jìn)行全基因序列測(cè)定和同源性分析。結(jié)果表明，gdh，cps2J、mrp、ef、sly、orf2和fbps基因在8個(gè)SS2分離株中的檢出率分別為100％(8/8)、100％(8/8)、62.5％(5/8)、75％(6/8)、87.5(7/8)、100％(8/8)和100％(8/8)；其中cps2J全基因核苷酸及推導(dǎo)的氨基酸序列與來(lái)源不同的SS2分離株同源性分別達(dá)98％和97％以上，以該基因構(gòu)建的

4、系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)表明8株SS2河南分離株與國(guó)內(nèi)外不同參考株同源性高，親緣關(guān)系密切。
　　 2.豬鏈球菌血清2型cps2H基因的表達(dá)及抗原性分析
　　 為研究SS2莢膜多糖cps2H重組蛋白的抗原性，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增ZMDSC-2(SS2)株的cps2H全基因，將擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD18-T克隆載體連接，重組質(zhì)粒經(jīng)PCR、酶切鑒定后進(jìn)行測(cè)序；將構(gòu)建的pET32a(+)-cps2H原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)

5、表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE和Western-blouing分析后，將純化的cps2H重組蛋白免疫小鼠，用ELISA檢測(cè)其血清抗體。結(jié)果顯示：cps2H全基因?yàn)?371bp，表達(dá)的重組蛋白大小為66.2KDa，最佳的誘導(dǎo)條件為1.0mmol/L的IPTG誘導(dǎo)3h，重組蛋白與SS2陽(yáng)性血清的免疫印記分析呈陽(yáng)性反應(yīng)；小鼠免疫第7天后血清中即可檢測(cè)到抗cps2H重組蛋白的特異性抗體，并于免疫后第28天達(dá)到高峰。上述結(jié)果表明：cps2H重

6、組蛋白具有良好的抗原性，可作為SS2的疫苗候選分子和免疫診斷抗原。
　　 3.豬鏈球菌血清2型環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用
　　 為了建立快速、靈敏的SS2LAMP檢測(cè)方法，根據(jù)GenBank登錄的SS2特異的莢膜多糖(cps2H)基因序列作為檢測(cè)靶標(biāo)，在其序列的保守區(qū)域設(shè)計(jì)LAMP引物，利用參考菌株S735(SS2)基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，優(yōu)化了LAMP的反應(yīng)條件和反應(yīng)體系，并進(jìn)行了敏感性、特異性和重復(fù)性

7、試驗(yàn)。結(jié)果表明：利用建立的LAMP方法對(duì)SS2進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物顯色呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，電泳出現(xiàn)階梯狀條帶，最低檢測(cè)量為0.186fg/μL模板DNA，比常規(guī)PCR高1000倍；且與其他常見(jiàn)的細(xì)菌無(wú)交叉反應(yīng)，臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果表明，建立的LAMP方法優(yōu)于普通PCR方法。說(shuō)明本研究建立的LAMP方法具有靈敏、特異、快速和重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，適用于本病的實(shí)驗(yàn)室快速檢測(cè)。
　　 4.豬鏈球菌種及1、2、7、9型多重PCR方法的建立及應(yīng)用

8、　　 根據(jù)SS谷氨酸脫氫酶(gdh)基因序列和SS1(14)、SS2(1/2)、SS7、SS9的型特異cps1I、cps2H、cps7H、cps9G基因序列，分別設(shè)計(jì)一對(duì)種特異性引物和4對(duì)型特異性引物，通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了鑒定SS及SS1(14)、SS2(1/2)、SS7、SS9的多重PCR檢測(cè)方法，該方法的特異性和敏感性均良好。應(yīng)用建立的多重PCR方法對(duì)臨床上的61份無(wú)臨床癥狀豬扁桃體進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，61份豬扁桃體SS檢出

9、率為77.0％(47/61)，其中SS2占14.8％(9/61)，SS7占4.9％(3/61)，SS9占32.8％(20/61)，無(wú)SS1存在。該方法可作為SS快速診斷和分子流行病學(xué)研究的重要手段。
　　 5.豬鏈球菌血清2型抗體IHA檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用
　　 為了建立適用臨床上檢測(cè)SS2抗體的IHA檢測(cè)方法，用SS2的莢膜多糖(capsularpolys-accharide，CPS)致敏經(jīng)戊二醛處理過(guò)的雞紅細(xì)胞，優(yōu)化

10、致敏醛化紅細(xì)胞的抗原量和時(shí)間。在37℃條件下CPS(2.25μg/mL)致敏雞紅細(xì)胞90分鐘，IHA試驗(yàn)在25℃條件下操作，被檢血清IHA效價(jià)在1:8及其以上時(shí)判為SS2抗體陽(yáng)性。應(yīng)用此方法對(duì)豬大腸桿菌、副豬嗜血桿菌、豬腸球菌、SS1、SS7、SS9、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、巴氏桿菌陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果SS2抗體均為陰性。對(duì)1044份無(wú)臨床癥狀的豬血清進(jìn)行檢測(cè)，SS2抗體陽(yáng)性率為61.69％。該方法敏感性高，特異性較強(qiáng)，可用于大規(guī)模