二化螟Bt殺蟲晶體蛋白的受體基因克隆、表達分析及RNA干擾.pdf

1、蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是可產(chǎn)生Bt殺蟲晶體蛋白的一種革蘭氏陽性菌，具有毒力高、對人畜與天敵安全、不污染環(huán)境的優(yōu)點，已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于害蟲防治中。隨著Bt殺蟲晶體蛋白對農(nóng)業(yè)害蟲的選擇壓力增強，其抗性問題逐漸引起了人們的高度重視。Bt殺蟲晶體蛋白的殺蟲機制一般認為有兩種可能的機制:一是中腸穿孔，二是信號傳導導致細胞凋亡。兩種機制都與Bt毒素受體蛋白密切相關(guān)。害蟲中腸組織中與Bt殺蟲晶體蛋白有互作的

2、基因包括鈣粘蛋白（Cadherin，CAD）、氨肽酶(Aminoopeptidase N，APN)、堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）、糖脂轉(zhuǎn)移酶（Glycosyltransferase，GT）等。其中，對堿性磷酸酶和糖脂轉(zhuǎn)移酶的研究較少。
　　 本文以水稻重要害蟲二化螟(Chilo suppressalis)為研究對象，克隆了二化螟Bt殺蟲晶體蛋白的受體基因，擴增了部分基因的全長，并進行了RNA干擾

3、分析。
　　 1、二化螟中定量PCR內(nèi)參基因的篩選
　　 實時熒光定量PCR技術(shù)（qRT-PCR）能夠快速地對多個樣品進行基因表達分析，成為芯片和微點陣數(shù)據(jù)驗證的常用手段。為了得到更精確的數(shù)據(jù)，通常需要一個和多個內(nèi)參基因來對qRT-PCR數(shù)據(jù)進行歸一化分析。本文檢測了actinA1、GAPDH、G3PDH、E2F、rp49等5個持家基因在二化螟不同齡期和不同組織中的穩(wěn)定性，利用geNorm、NormFinder、stab

4、ility index' assay和ΔCt analysis選擇其最佳內(nèi)參。結(jié)果表明:在二化螟中最穩(wěn)定的基因是actinA1;不同組織中，rp49和actinA1最適合同時作為內(nèi)參;不同齡期發(fā)育中，G3PDH和E2F最適合同時作為內(nèi)參。該結(jié)果為二化螟基因表達分析時內(nèi)參基因的選擇提供了參考。
　　 2、二化螟Bt殺蟲晶體蛋白的受體相關(guān)基因全長克隆
　　 克隆得到二化螟中Bt殺蟲晶體蛋白4類受體基因的全長序列，包括1個鈣粘

5、蛋白、3個氨肽酶、3個堿性磷酸酯酶和4個糖脂轉(zhuǎn)移酶基因。此外，還獲得了14個5'UTR序列和16個3，UTR序列。對已獲得全長序列的基因做了進化關(guān)系分析。結(jié)果表明，CAD1與鱗翅目的家蠶、小菜蛾的鈣粘蛋白在進化距離上相近，CAD2與雙翅目的果蠅鈣粘蛋白相近;其他一些基因均與鱗翅目部分昆蟲的類似基因進化距離較近。
　　 3、二化螟Bt殺蟲晶體蛋白的受體基因在不同齡期中腸組織中表達分析
　　 分析二化螟中4類Bt殺蟲晶體蛋白

6、受體基因的表達量變化，對于基因的功能研究具有重要意義。研究了Bt殺蟲晶體蛋白的受體基因在二齡、三齡、四齡、五齡、六齡幼蟲，成蟲等不同發(fā)育階段中腸組織中的表達量變化。結(jié)果表明，成蟲中腸中所有4類受體基因均低表達。兩個鈣粘蛋白和兩個堿性磷酸酶在不同發(fā)育階段的表達量變化趨勢一致，由二齡幼蟲到老熟幼蟲期間的表達量持續(xù)升高，成蟲期降至與二齡幼蟲相似的表達量。三個氨肽酶基因在幼蟲期的表達量變化不大，到成蟲期急劇下降至幼蟲期的百分之一以下。三個糖脂轉(zhuǎn)

7、移酶之間有一定差異，其中GT3在中腸組織中表達量基本一致，但是GT1和GT2成蟲中表達量均低于其他齡期。
　　 4、鈣粘蛋白在二化螟不同組織中的表達分析及其RNA干擾
　　 利用定量PCR技術(shù)分析了兩個鈣粘蛋白在中腸、頭、脂肪體、表皮等組織中的表達量差異。CAD1在中腸中的表達量顯著高于其他組織，是頭部的2000倍;CAD2在不同組織中的表達量差異不顯著。合成了兩個鈣粘蛋白的siRNA，通過喂食法進行RNA干擾。利用定量