二化螟ALP基因家族Cry蛋白受體功能分析.pdf

1、二化螟Chilo suppressalis(Walker)是我國乃至世界范圍內(nèi)為害最嚴(yán)重的水稻害蟲之一。轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲水稻的研發(fā)成功地減少了化學(xué)農(nóng)藥的使用，研究其殺蟲機(jī)理和靶標(biāo)害蟲對它的抗性機(jī)理非常有必要?；诖?，本研究開展了二化螟中腸的假想受體堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)基因家族的克隆、序列分析、Cry蛋白與假定受體基因的結(jié)合特性及其受體功能的研究，主要結(jié)果如下:
　　1.通過對二化螟中腸轉(zhuǎn)錄組

2、數(shù)據(jù)庫篩選整理并結(jié)合二化螟基因組數(shù)據(jù)庫(http://ento.njau.edu.cn/ChiloDB/)的補(bǔ)充驗(yàn)證以保證ALP家族基因的完整克隆，采用RACE技術(shù)克隆共獲得二化螟6個(gè)ALP基因家族成員的cDNA全長序列，其中3個(gè)基因已為GenBank收錄:CsALP1、CsALP2、CsALP3，3個(gè)為新克隆基因:CsALP4、CsALP5、CsALP6，對這3個(gè)基因進(jìn)行序列分析表明，編碼蛋白質(zhì)分子量分別為56.79、55.68和59

3、.77 kD，具有N-、O-糖基位點(diǎn)，具有和Cry蛋白結(jié)合相關(guān)的GPI錨定位點(diǎn)。
　　2.假想受體基因與Cry蛋白的結(jié)合特性分析:利用大腸桿菌系統(tǒng)體外表達(dá)二化螟ALP基因家族各等位基因，通過Ni2+柱純化獲得重組受體蛋白的純蛋白，經(jīng)過脫鹽透析并用Bradford法進(jìn)行蛋白定量，用Cry蛋白(Cry1Ac、Cry2Aa和Cry1Ca)分別與各表達(dá)蛋白開展點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)，初步驗(yàn)證了各CsALPs多肽可以與三種Cry蛋白結(jié)合。
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4、.合成假定受體基因的dsRNA，用喂食法進(jìn)行RNA干擾。利用定量PCR技術(shù)檢測喂食dsRNA24小時(shí)后靶標(biāo)基因mRNA表達(dá)量變化，CsALP1、CsALP2、CsALP3、CsALP4和CsALP5基因表達(dá)量明顯下調(diào);而CsALP6基因表達(dá)量下降不顯著?；蚬δ芊治霰砻鳎珻sALP1、CsALP2和Cs ALP4為Cry1Ac、Cry2Aa和Cry1Ca的功能受體;CsALP3為Cry1Ac和Cry1Ca的功能受體;CsALP5和CsA