禾谷鐮孢菌Fusarium graminearum α、β2-微管蛋白的原核表達、體外聚合及藥物結(jié)合研究.pdf

1、禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum）在生產(chǎn)中主要引起小麥赤霉病、玉米莖基腐病和穗腐病及水稻穗腐病，它不但造成作物產(chǎn)量損失，而且該菌產(chǎn)生的毒素對作物的品質(zhì)造成嚴重的降低。主要由禾谷鐮孢菌引起的小麥赤霉病是小麥生產(chǎn)中的一種毀滅性病害，苯并咪唑類殺菌劑如多菌靈是防治小麥赤霉有效的藥劑。當前，禾谷鐮孢菌已對多菌靈產(chǎn)生了嚴重的抗藥性，小麥赤霉病發(fā)生有愈發(fā)嚴重的趨勢，生產(chǎn)中急需防治小麥赤霉病的多菌靈替換藥劑。
　　 通過遺

2、傳轉(zhuǎn)化及基因定點突變技術(shù)，本實驗室已證明了禾谷鐮孢菌對多菌靈的抗藥性是由其β2-微管蛋白基因突變引起，其突變位點包括F167Y、E198K或E198L、F200Y，50位點突變體也可產(chǎn)生對多菌靈的低抗。但尚未有從蛋白質(zhì)水平上研究β2-微管蛋白氨基酸突變與多菌靈抗性關系的報道。
　　 微管由微管蛋白(tubulin)和微管相關蛋白（Microtubule associated proteins，MAPs）組成，其中α、β-微管蛋白

3、聚合形成的異源二聚體，是微管的基本單位。α、β-微管蛋白處于一個聚合/解聚的動態(tài)過程，多種以微管蛋白為靶標的藥物都是同微管蛋白結(jié)合后抑制了微管的動態(tài)過程而發(fā)揮藥理作用的。目前已開發(fā)出基于微管蛋白體外聚合為靶標的抗腫瘤藥物篩選模型，但絲狀真菌的微管蛋白還沒有在離體條件下用作殺菌劑創(chuàng)制及篩選的靶標。
　　 為了研究禾谷鐮孢菌α、β-微管蛋白的體外聚合反應并以此開發(fā)出殺菌劑的離體篩選模型，以及在蛋白水平上理解禾谷鐮孢菌對多菌靈的抗藥性

4、實質(zhì)，本文在大腸桿菌中表達了禾谷鐮孢菌α、β-微管蛋白，并進行了體外聚合及藥劑結(jié)合研究，結(jié)果如下:
　　 以禾谷鐮孢菌cDNA為模板，PCR擴增出α1、α2-微管蛋白基因，將其克隆到pET30a+表達載體上，轉(zhuǎn)化到宿主菌Rossatta(DE3)pLysS，篩選陽性克隆，進行蛋白誘導表達。SDS-PAGE及Western-blot結(jié)果表明:融合蛋白主要以包涵體形式存在，分子量約為52.1 kD和55.9 kD;融合蛋白能與抗Hi

5、s-tag的單抗發(fā)生特異性反應。通過對包涵體洗滌及透析復性后采用HisTrapTMHP Columns對融合蛋白進行純化，可以得到純度較高的微管蛋白。
　　 以構(gòu)建好的(pET32a-β2-tubulin)重組質(zhì)粒為模板，PCR擴增出β2-微管蛋白基因，將其克隆到pET30a+表達載體上，并轉(zhuǎn)化到宿主菌BL21(DE3)及Rossatta(DE3)pLysS，篩選陽性克隆，進行蛋白誘導表達，并篩選蛋白可溶性表達的誘導因子;對純化

6、后的蛋白進行SDS-PAGE和Western Blot驗證。最終獲得了在大腸桿菌中表達效率高的陽性克隆;通過對誘導溫度、誘導物濃度、誘導時間、初始誘導時的菌液濃度、培養(yǎng)液、誘導物種類及宿主菌等七因子的綜合分析，獲得了β2-微管蛋白可溶性表達的誘導條件;利用HisTrapTM HP Columns對β2-微管蛋白進行純化，可獲得純度很高的可溶性β2-微管蛋白。SDS-PAGE確認表達出的融合蛋白分子量約為51.6 kD;Western-b

7、lot證實表達的融合蛋白能與His-tag及β-微管蛋白的單克隆抗體發(fā)生特異性反應。
　　 通過改變誘導條件獲得禾谷鐮孢菌可溶性的α-微管蛋白，包括降低誘導溫度和誘導物濃度，延長誘導時間。誘導條件改變對α-微管蛋白總量無影響，但可使包涵體中的蛋白量下降而上清中可溶性的蛋白量增加，其中上清中α1-微管蛋白的增加量較α2-微管蛋白多，說明α1-微管蛋白在大腸桿菌里更容易可溶性表達。利用HisTrapTM HPColumns對融合蛋白

8、進行純化，可獲得純度很高的可溶性α-微管蛋白;Western-blot證實表達的融合蛋白能與His-tag及α-微管蛋白的單克隆抗體發(fā)生特異性反應，說明α-微管蛋白在提取及純化過程中始終保持著結(jié)構(gòu)上的完整性。
　　 研究了禾谷鐮孢菌微管蛋白的體外聚合反應。微管蛋白純化后經(jīng)過透析、濃縮，可以在體外無微管相關蛋白下發(fā)生聚合反應。聚合的條件是:反應在Pipes buffer中進行，微管蛋白濃度1 mg·mL-1，GTP濃度2mmol·

9、L-1;反應溫度37℃，反應時間60m，DMSO對聚合無影響;聚合在96孔酶標板上進行，在酶標儀350nm處測定反應60m之內(nèi)的吸光度，每隔12s讀數(shù)一次。結(jié)果表明:α2、β2-微管蛋白的聚合程度比α1、β2-微管蛋白聚合程度強;多菌靈加入可顯著地抑制α1、β2或α2、β2-微管蛋白的聚合，但對已發(fā)生聚合的微管無作用;多菌靈對微管蛋白體外聚合的抑制同其活體條件下對出發(fā)菌株的抑菌效果相同。幾類藥物對α、β2-微管蛋白聚合的影響不同，同其活

10、體抑菌活性也不完全一致，表明禾谷鐮孢菌α1、β2-微管蛋白的體外聚合反應可用在藥物的初步篩選中。
　　 在大腸桿菌中利用pET32a+成功表達了禾谷鐮孢菌不同抗性菌株的β2-微管蛋白，改變誘導條件，使β2-微管蛋白得到了可溶性表達并進行了自然條件下的純化。不同位點的氨基酸突變對融合蛋白表達總量及可溶性蛋白表達量無明顯差異。純化的β2-微管蛋白對His-tag及β-微管蛋白單克隆抗體均有反應，說明蛋白在提取及純化過程中一直保持著結(jié)

11、構(gòu)完整性。盡管pET32a+表達出的融合蛋白N端有大約17.3kD的標簽蛋白，但同α-微管蛋白體外聚合特性與pET30a+表達的融合蛋白無差異，多菌靈對聚合的影響也相同，說明N端的標簽蛋白對β2-微管蛋白與α1-微管蛋白體外聚合無影響。不同抗性菌株β2-微管蛋白與α1-微管蛋白的體外聚合存在著顯著差異，198位突變導致聚合程度加強;但多菌靈對抗性菌株β2-微管蛋白與α1-微管蛋白的體外聚合無影響，表明β2-微管蛋白發(fā)生點突變后與多菌靈的

12、親和力降低。
　　 采用熒光淬滅的方法研究了禾谷鐮孢菌β-微管蛋白及不同抗性菌株β2-微管蛋白同多菌靈的體外親和性。多菌靈對所有的融合蛋白都具有熒光淬滅效應，對敏感菌株β2-微管蛋白的熒光淬滅率最高，對雙位點突變菌株(52-7)β2-微管蛋白熒光淬滅率最低，但對中抗菌株β2-微管蛋白的淬滅率低于高抗菌株JT04和點突變體E198K。藥劑平衡試驗表明，微管蛋白濃度2μmol·L-1，多菌靈濃度在20μmol·L-1時對融合蛋白的熒

13、光淬滅率達到最大值，故選取該濃度進行藥劑動力學研究。結(jié)果表明:β2-微管蛋白與多菌靈的體外結(jié)合速率和出發(fā)菌株對多菌靈的抗性水平呈負相關，抗性水平高的菌株有較低的結(jié)合速率Kon;而解離速率Koff則同抗性水平呈正相關，抗性水平高解離速率大;親和常數(shù)Ka同多菌靈抗性水平呈負相關，敏感菌株的β2-微管蛋白與多菌靈的親和常數(shù)大于抗性菌株的。β1-微管蛋白與多菌靈的親和常數(shù)Ka介于敏感菌株β2-微管蛋白和低抗點突變體Y50Cβ2-微管蛋白之間，表