河西走廊蘆葦根際土壤耐鹽鏈霉菌的分離、鑒定及抗菌活性研究.pdf

1、鏈霉菌(Streptomyces)作為一種廣泛分布于土壤中的常見微生物,在分類學(xué)地位上屬于一類高G+C的革蘭氏陽(yáng)性放線菌,因其能產(chǎn)生藥用抗生素等天然活性物質(zhì)而倍受關(guān)注。近年來(lái)為解決病原菌耐藥性難題,從極端環(huán)境中分離產(chǎn)新抗生素的鏈霉菌新種,成為研究的焦點(diǎn)。本論文對(duì)采自甘肅省河西走廊中段臨澤地區(qū)4種典型生態(tài)型蘆葦(Phragmites communis)根際與非根際8份鹽堿土壤樣品進(jìn)行了鏈霉菌的分離及篩選,16S rRNA基因序列分子鑒定和

2、抗菌活性測(cè)定,最后對(duì)已鑒定的具有強(qiáng)抗菌能力的10株菌進(jìn)行了最適生長(zhǎng)鹽度測(cè)定等研究。旨在探究河西走廊沙漠南麓臨澤鹽堿區(qū)蘆葦根際及根周土壤中潛在的鏈霉菌及其抗菌活性,以期發(fā)現(xiàn)新藥用鏈霉菌資源,豐富鏈霉菌資源庫(kù)并為新型抗生素的開發(fā)奠定一定基礎(chǔ)。取得了以下研究成果。
　　1.鏈霉菌的分離、純化。采用稀釋涂布法與平板劃線法共篩選出355株菌。1 mol/L NaCl條件下分到285株,此鹽環(huán)境中分布了大量的鏈霉菌群落,尤其以水生蘆葦根際土壤

3、(SR-R)與沙丘生蘆葦根際土樣(DR-R)最占優(yōu)勢(shì)。2 mol/L NaCl條件下分得70株,以重度鹽堿草甸蘆葦根際土壤(HSMR-R)居多,輕度鹽化草甸蘆葦根際土樣(LSMR-R)次之。從培養(yǎng)特征看,SR-R與水生蘆葦非根際土樣(SR-BS)中存在的鏈霉菌多屬于白孢類群、灰褐類群、燼灰類群和吸水類群,且SR-R中的菌株在后期多數(shù)能產(chǎn)生可溶色素和出現(xiàn)菌絲自溶現(xiàn)象,而SR-BS中的菌株孢子絲出現(xiàn)了高度分化以致形態(tài)差異較大。DR-R中的菌

4、株以粉孢類群、灰紅紫類群為主,燼灰類群次之,且大部分菌株氣絲生長(zhǎng)量少甚至無(wú)菌絲生長(zhǎng),表現(xiàn)出較為濕潤(rùn)的菌落表面。DR-BS中以白孢類群、藍(lán)色類群為主,少數(shù)菌生長(zhǎng)后期在培養(yǎng)基上呈現(xiàn)出透亮水解圈。LSMR-R與HSMR-R中篩出的菌株較1 mol/L NaCl下分得菌株個(gè)體小且菌落表觀色澤暗淡,以灰紅紫類群、灰褐類群與白孢類群為主。
　　2.菌株的16S rRNA基因分子鑒定。采用序列分析法對(duì)分離出的105株菌進(jìn)行分子鑒定,測(cè)序結(jié)果經(jīng)B

5、last比對(duì)顯示,95.24％以上的鑒定菌株都為鏈霉菌屬且相似度高達(dá)98.00%以上。菌株SR-BS2、SR-BS21、DR-R8、DR-R36、DR-R40與模式菌的相似度較低,約97.16%-97.93%之間,有可能為潛在新種。鹽化(SMR)土樣中所分出的幾株菌經(jīng)鑒定有5株為擬諾卡氏菌。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,分析與模式菌獨(dú)聚成一枝且具高同源性的菌,通過(guò)種間的親緣關(guān)系確定出同分支上的兩者屬于同一個(gè)種。并解讀出了其他各菌株的分類地位與進(jìn)化程度

6、。菌株SR-R18與S. variabilis NBRC12825T有100%的親緣關(guān)系;SR-R27與SR-R35同S. viridodiastaticus NBRC13106T和S. variabilis strain173893聚集成枝,且同源性分別為99.63%、98.98%;DR-R31與S. luteogriseus strain NBRC13402表現(xiàn)出很近的親緣關(guān)系,但兩者的同源性卻只有92.91%。
　　3.鏈霉

7、菌抗菌能力測(cè)定。采用瓊脂塊轉(zhuǎn)移培養(yǎng)法對(duì)230株鏈霉菌進(jìn)行拮抗性實(shí)驗(yàn)。共有185株具有抗細(xì)菌活性,占到分離菌總數(shù)的52.11%,其中具有廣譜拮抗性的147株菌,占到鏈霉菌活性菌株的79.46%。在抗菌初篩實(shí)驗(yàn)中,從1mol/L SR-R與2mol/L LSMR-R中分得的鏈霉菌占據(jù)主要優(yōu)勢(shì)且抑菌能力強(qiáng),1mol/L SR-BS中的菌株抑制效果次之。具有中、強(qiáng)抗菌能力的鏈霉菌菌株,以燼灰類群、吸水類群與藍(lán)色類群居多, SR-R與SR-BS中

8、的菌株主要為S. variabilis, S. griseorubens, S. griseoincarnatus, S. coeruleorubidus,S. coelicolor等,DR-R中還有S. coeruleorubidus,S. coerulescens,S. azureus等,DR-BS中還包括S. coeruleofuscu,S. anandii。2 mol/L LSMR-R中的拮抗菌以S. griseorubens與

9、S. mutabilis居多。表明在甘肅臨澤干旱沙漠區(qū)的不同生態(tài)蘆葦根際與非根際土壤中蘊(yùn)藏了豐富的藥用鏈霉菌資源。
　　4.耐鹽性測(cè)定。測(cè)試鏈霉菌的最適生長(zhǎng)鹽度范圍為1%-10%,當(dāng)增加到10%-12.5%時(shí),中度耐鹽鏈霉菌能正常生長(zhǎng)。12.5%-15%間有少數(shù)菌能繼續(xù)存活,但基本不生長(zhǎng)。隨著鹽度的升高,菌體干重整體出現(xiàn)降低趨勢(shì),菌株DR-BS15的干重與鹽濃度呈顯著負(fù)相關(guān)。菌株SR-R56、SR-BS9、DR-R43、LSMR-

10、R1-2M和HSMR-R38-2M在15%的鹽度中延滯期長(zhǎng)且于第6d開始進(jìn)入對(duì)數(shù)期,15%時(shí)菌體量開始增加表明它們可能是一些高度耐鹽菌,尤以HSMR-R38-2M表現(xiàn)最為明顯。當(dāng)鹽濃度低于7.5%時(shí),菌株DR-R27和DR-R43在第7d進(jìn)入穩(wěn)定期,而鹽濃度高于12.5%時(shí)才開始進(jìn)入對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期,且在第7d仍表現(xiàn)為繼續(xù)上升趨勢(shì),表明這兩株菌在高于15%的鹽度下仍能生長(zhǎng)。隨著鹽度的增加,各菌株延滯期逐漸變長(zhǎng)且對(duì)數(shù)期的增長(zhǎng)率減慢。菌株DR-B