綠僵菌和白僵菌防蝗菌株的分子鑒定及室內(nèi)致病力測定.pdf

1、綠僵菌和白僵菌已廣泛運用于害蟲生物防治中,且被開發(fā)成不同劑型的高效真菌殺蟲劑。目前防治蝗蟲的殺蟲劑較多,但是真正有效的殺蝗真菌殺蟲劑仍然寥寥無幾。因此篩選高毒殺蝗的昆蟲病原真菌菌株,可為蝗蟲的生物防治奠定堅實的基礎(chǔ)。本論文首先采用DGGE方法篩出不同基因型菌株,再進行EF序列的擴增和測序,通過比對和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,將各菌株準確鑒定。然后在菌株室內(nèi)致病力的測定研究中主要采用浸蟲法和餌劑喂食法來確定致病力較強的菌株。最后通過對高致病力菌株部

2、分生物學(xué)特性測定,為篩選出生產(chǎn)性狀良好的菌株提供必要數(shù)據(jù)?，F(xiàn)將主要結(jié)果陳述如下:
　　1、菌株的分子鑒定。
　　(1)球孢白僵菌菌株DGGE初篩。通過DGGE圖譜分析,結(jié)果顯示:檢測的27株球孢白僵菌共有6個基因型,分別為基因型A:Bb854,基因型B:Bb1028、Bb6、Bb860、Bb125,基因型C:Bb292、Bb654、Bb1179、Bb2270、Bb321、Bb322、Bb458、Bb859、Bb1372、Bb

3、1843、Bb2153、Bb2157、Bb2248、Bb2250、Bb2251,基因型D:Bb1519、Bb2253、Bb1906、Bb1975,基因型E:Bb1062、Bb2268,基因型F:Bb324。
　　(2)菌株EF序列測定、比對及分子鑒定。從6個基因型中各選擇1株球孢白僵菌,結(jié)合初步形態(tài)學(xué)鑒定為其他種的4株菌株Vl325、Ic449、Bbr91、Ma63共10株,分別提取基因組DNA,以983F、2218R為引物進行P

4、CR擴增,測序。在GenBank上進行Blast比對,同源性比對結(jié)果表明:6個基因型的菌株之間的序列均有一定差異,差異在99％以內(nèi),但都和球孢白僵菌的模式菌株近似,序列差異在99-100%之間。通過序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹分析,結(jié)果表明:通過DGGE研究的6個基因型共27株菌株均可鑒定為球孢白僵菌Beauveriabassiana。其他4株非球孢白僵菌的蟲生真菌菌株Vl325、Ic449、Bbr91和Ma63分別鑒定為刀孢蠟蚧菌Lecani

5、cilliumpsalliotae、環(huán)鏈棒束孢Isariacateniannulata,布氏白僵菌Beauveriabrongniartii、蝗綠僵菌Metarhiziumacridum。將這些已明確分類地位的菌株,再結(jié)合它們的產(chǎn)孢特點,最終確定以下菌株進行室內(nèi)生測試驗:Bb6、Bb860、Bb292、Bb654、Bb1179、Bb2270、Bb1519、Bb1906、Bb2253、Bbr91、Ma63。
　　2、室內(nèi)致病力測定。

6、
　　(1)蝗蟲室內(nèi)飼養(yǎng)?；嚷言?0℃,相對濕度50~75%,光照12h的孵化天數(shù)為6~12d,結(jié)果表明:蝗卵孵化率在59.0~71.2%之間,其平均孵化率達到了65.0%?；闰镌?5~30℃,濕度30~50%,光照12~16h,結(jié)果表明:蛻皮天數(shù)為7~8d。從蝗卵孵化到我們所需要的3齡蝗蝻,共需27-36天。
　　(2)室內(nèi)致病力測定。在室內(nèi)用浸蟲方法測定了11株菌株對東亞飛蝗3齡蝗蝻的致病力,初步篩選出死亡率較高的4株球

7、孢白僵菌和1株金龜子綠僵菌,結(jié)果顯示:校正死亡率較高分別為100%、93.3%、90%、86.7%、83.3%,致病力順序為Bb860>Ma63>Bb1906>Bb2270>Bb1519,它們LT50分別為3.04d、4.17d、4.37d、4.50d、5.76d。然后采取浸蟲和喂食餌劑的方法,對初步篩選出的5株菌株進行進一步研究。結(jié)果表明:喂食餌劑的情況下,Ma63、Bb860、Bb2270、Bb1906對3齡蝗蝻的死亡率最高,LT5

8、0最短分別為4.81d、4.37d、5.00d、5.94d。采用浸蟲方法的情況下,菌株致死中濃度LC50的順序依次為Bb860

9、63、Bb1519的校正死亡率依次為75.9%、72.4%、69%、69%、55.2%,致死中時依次為6.77d、7.32d、7.45d、7.75d、9.44d。25℃下菌株Bb860、Ma63、Bb1906、Bb2270、Bb1519的校正死亡率依次為100%、100%、89.7%、89.7%、82.8%,致死中時依次為3.13d、4.10d、4.53d、4.39d、5.87d。
　　3、高致病力菌株的生物學(xué)特性
　　通過

10、對Ma63、Bb860、Bb1906、Bb2270四株菌株的菌落形態(tài)、分生孢子形態(tài)、產(chǎn)孢量、萌發(fā)率及生長速度幾方面的研究,進一步了解菌株的生物學(xué)特性。研究結(jié)果表明:Bb860、Bb1906和Bb2270均菌落表面疏松、絨毛狀,孢子近球形,單細胞,大小在1.5~2.8×1.5~2.4μm范圍,Bb2270呈淡黃色,且背面黃棕色,而Bb860、Bb1906菌落白色,背面均為淡黃色。菌株Ma63為緊密、絨毛狀,孢子圓柱形,兩端頓圓,單細胞,3

11、.8~5.3×2.4~3.3μm,正面黃綠色,背面橄欖色。菌株產(chǎn)孢量測定結(jié)果顯示:Bb860>Bb2270>Ma63>Bb1906,依次為2.8×107個/cm2、2.3×107個/cm2、2.0×107個/cm2、1.3×107個/cm2;其中孢子萌發(fā)率分別為98.0%、96.7%、93.7%、96.0%;Bb860、Ma63、Bb1906、Bb2270菌落在25℃SDAY培養(yǎng)基上平均每天生長量分別為18.36mm、14.94mm、1