養(yǎng)殖大菱鲆波豆蟲(chóng)的分離培養(yǎng)、敏感性藥物分析及分子鑒定.pdf

1、魚(yú)波豆蟲(chóng)(Ichthyobodo necator)隸屬于鞭毛綱(Class flagellates)，動(dòng)基體目(Order Kinetoplastida)，是主要的魚(yú)類體外寄生蟲(chóng)之一，廣泛寄生于全球范圍內(nèi)的多種養(yǎng)殖淡水魚(yú)類，嚴(yán)重危害著世界魚(yú)類養(yǎng)殖業(yè)。近年來(lái)，世界各地在一些嚴(yán)格意義的海水魚(yú)類上都發(fā)現(xiàn)了與魚(yú)波豆蟲(chóng)非常相似的鞭毛蟲(chóng)類寄生蟲(chóng)。這表明魚(yú)波豆蟲(chóng)病可能不僅僅只是一個(gè)種的鞭毛類原生動(dòng)物引起的。我國(guó)關(guān)于魚(yú)波豆蟲(chóng)病的研究多集中在淡水養(yǎng)殖魚(yú)類

2、的疾病防治方面，海水養(yǎng)殖魚(yú)類感染魚(yú)波豆蟲(chóng)病的事例鮮有報(bào)道及研究。本研究此次在山東濰坊地區(qū)養(yǎng)殖大菱鲆(Scophthalmusmaximus)苗種上發(fā)現(xiàn)的魚(yú)波豆蟲(chóng)病，是我國(guó)魚(yú)波豆蟲(chóng)病在養(yǎng)殖大菱鲆上的首次報(bào)道。鑒定此次大菱鲆寄生蟲(chóng)病病原并進(jìn)行相應(yīng)的初步研究，可以為我國(guó)海水養(yǎng)殖魚(yú)類感染魚(yú)波豆蟲(chóng)病的研究積累一定的基礎(chǔ)資料并為我國(guó)大菱鲆(Scophthalmusmaximus)養(yǎng)殖中魚(yú)波豆蟲(chóng)病的防治提供理論參考。
　　 本研究共分四個(gè)部分

3、：通過(guò)現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查，顯微觀察和掃描電鏡觀察等基礎(chǔ)診斷方法對(duì)大菱鲆魚(yú)波豆蟲(chóng)病進(jìn)行初步診斷并得到其病原的形態(tài)學(xué)特征；利用原生動(dòng)物微量分離方法成功分離出大菱鲆魚(yú)波豆蟲(chóng)病病原并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件初步探索；選取四種常用魚(yú)病治療藥物進(jìn)行魚(yú)波豆蟲(chóng)敏感藥物篩選試驗(yàn)；設(shè)計(jì)魚(yú)波豆蟲(chóng)特異性引物進(jìn)行PCR分子擴(kuò)增反應(yīng)，結(jié)合序列比對(duì)構(gòu)建魚(yú)波豆蟲(chóng)中國(guó)株的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。
　　 1.養(yǎng)殖大菱鲆感染波豆蟲(chóng)病癥及病原觀察。分別利用光學(xué)顯微鏡和掃描電子顯微鏡進(jìn)行大菱鲆魚(yú)波

4、豆蟲(chóng)病病原形態(tài)學(xué)觀察與分析并得到了中國(guó)區(qū)系以大菱鲆苗種為宿主的病原形態(tài)學(xué)顯微照片，分析其形態(tài)學(xué)特征，確定此次我國(guó)北方濰坊地區(qū)大菱鲆苗種爆發(fā)的寄生蟲(chóng)病病原為魚(yú)波豆蟲(chóng)(Ichthyobodo necator)。同時(shí)通過(guò)對(duì)山東半島其他海水魚(yú)類寄生蟲(chóng)的調(diào)查發(fā)現(xiàn)了三種其他寄生蟲(chóng)，分別為：盾纖毛蟲(chóng)、淀粉卵渦鞭蟲(chóng)和一種未定種纖毛蟲(chóng)。
　　 2.利用原生動(dòng)物微量分離方法成功分離出病原魚(yú)波豆蟲(chóng)，篩選魚(yú)波豆蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)最佳培養(yǎng)條件。結(jié)果得出0.3g

5、/L牛肉浸膏培養(yǎng)液中，魚(yú)波豆蟲(chóng)能夠很快進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期，種群密度達(dá)到一個(gè)較高值，但持續(xù)時(shí)間不長(zhǎng)，很快進(jìn)入衰退期。魚(yú)波豆蟲(chóng)在1％的魚(yú)鰓組織勻漿上清培養(yǎng)液(EG培養(yǎng)液)中培養(yǎng)96h時(shí)，種群密度達(dá)到所有實(shí)驗(yàn)組中的最高種群密度，達(dá)到了450000ind/mL且在4天內(nèi)種群密度都保持在較高密度水平，種群在10天內(nèi)都保持在一個(gè)較為理想的生存狀態(tài)，且種群自然增長(zhǎng)率明顯高于牛肉浸膏培養(yǎng)液試驗(yàn)組。因此實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)時(shí)間維持培養(yǎng)選擇1％的魚(yú)鰓組織勻漿上清培養(yǎng)液較為

6、理想。不同溫度、鹽度條件下，中國(guó)區(qū)系魚(yú)波豆蟲(chóng)生長(zhǎng)情況結(jié)果顯示：魚(yú)波豆蟲(chóng)在4-30℃均可生存，22℃為其最佳生長(zhǎng)繁殖溫度。鹽度對(duì)魚(yú)波豆蟲(chóng)生長(zhǎng)繁殖影響不顯著，但本試驗(yàn)中的魚(yú)波豆蟲(chóng)在淡水環(huán)境中并未能正常生長(zhǎng)。
　　 3.試驗(yàn)使用的四種常用藥物硫酸銅、硫酸銅-硫酸亞鐵合劑、高錳酸鉀和福爾馬林對(duì)魚(yú)波豆蟲(chóng)都具有一定的滅殺效果，但綜合多種因素考慮，高錳酸鉀作為常用的滅菌劑，具有無(wú)殘毒無(wú)副作用，無(wú)異味施用方便，價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，因此在治療大菱鲆魚(yú)

7、波豆蟲(chóng)病時(shí)可優(yōu)先考慮。
　　 4.利用PCR擴(kuò)增技術(shù)以中國(guó)山東濰坊地區(qū)大菱鲆苗種上的魚(yú)波豆蟲(chóng)病原DNA為模板，進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。鑒定結(jié)果顯示：本次中國(guó)海水魚(yú)類身上發(fā)現(xiàn)的魚(yú)波豆蟲(chóng)與多個(gè)國(guó)家不同種魚(yú)波豆蟲(chóng)都具有較高相似度。通過(guò)將本實(shí)驗(yàn)對(duì)象與選取的14株不同國(guó)家不同宿主的魚(yú)波豆蟲(chóng)序列比對(duì)分析進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育研究后發(fā)現(xiàn)：中國(guó)地區(qū)以大菱鲆苗種為宿主的魚(yú)波豆蟲(chóng)在親緣關(guān)系上與巴西國(guó)王黑鯛上寄生的魚(yú)波豆蟲(chóng)同屬一枝，與美國(guó)鱸屬類上寄生的和劍尾魚(yú)上寄