大豆腺苷酸激酶基因GmADK的克隆、載體構(gòu)建與大豆遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、腺苷酸代謝是初生代謝的重要組成部分，腺苷酸類化合物的含量變化被認為是影響細胞能量代謝的主要因素之一。腺苷酸激酶(adenylate kinase，ADK，EC.2.7.4.3)催化ATP和AMP合成兩分子ADP的可逆反應(yīng)，是生成ADP和平衡腺苷磷酸類化合物代謝的關(guān)鍵酶，是調(diào)控腺苷酸庫容大小的靶標(biāo)分子，其表達量直接影響腺苷酸在核甘酸代謝庫和細胞代謝庫中的分配。曾有研究表明，通過反義ADK基因表達載體轉(zhuǎn)化馬鈴薯，降低了ADK的活性，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基

2、因馬鈴薯塊莖中腺苷酸含量增加，使塊莖產(chǎn)量增加了39％，增產(chǎn)效果極其顯著。另一些研究表明，ADK可能與植物對鹽、旱等非生物脅迫的耐性有關(guān)。目前，關(guān)于大豆中的ADK方面的研究還未見報道。
　　 大豆遺傳轉(zhuǎn)化是大豆分子育種、種質(zhì)資源創(chuàng)新和基因功能研究的重要手段。農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法具有拷貝數(shù)低、遺傳穩(wěn)定、基因沉默現(xiàn)象少和成本低等優(yōu)勢，但其轉(zhuǎn)化周期長、轉(zhuǎn)化效率低、嵌合體比率高等問題仍未徹底解決。
　　 本研究依據(jù)大豆改良中心提供的大

3、豆耐鹽主效QTL定位信息，經(jīng)過基因組學(xué)分析查詢到位于該區(qū)間的候選基因腺苷酸代謝途徑的關(guān)鍵酶——腺苷酸激酶。根據(jù)大豆數(shù)據(jù)庫中基因的編碼序列設(shè)計特異引物，克隆得到GmADK基因，并應(yīng)用生物信息學(xué)手段分析GmADK基因及其蛋白的特性，構(gòu)建了植物過表達載體和RNA干擾載體，并對大豆進行了遺傳轉(zhuǎn)化。具體如下:
　　 通過RT-PCR方法從大豆品種“南農(nóng)1138-2”中克隆得到大豆腺苷酸激酶基因(GmADK)，使用Gateway方法構(gòu)建了植

4、物過表達載體和RNA干擾載體，并進行了生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明:克隆得到的GmADK編碼序列為801 bp，編碼由267個氨基酸殘基構(gòu)成的多肽。預(yù)測其亞細胞結(jié)構(gòu)定位于質(zhì)體，具有典型的腺苷酸激酶蛋白功能域ATP-AMP(Ap5A)結(jié)合位點和AMP結(jié)合位點，蛋白質(zhì)三維模型具有典型的ADK蛋白立體結(jié)構(gòu)。將構(gòu)建好的載體分別導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105，獲得了工程菌菌株，并對不同的大豆品種進行轉(zhuǎn)化，以驗證GmADK基因的功能。
　　 同

5、時，為了優(yōu)化農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化體系，本研究以不同基因型大豆的子葉節(jié)外植體為研究對象，分別以bar和hyg為篩選標(biāo)記基因，gus為報告基因，進行了大豆遺傳轉(zhuǎn)化實驗。通過對轉(zhuǎn)化過程中各個影響因素的研究，在轉(zhuǎn)化實驗過程中實施了一系列優(yōu)化措施，旨在通過提高叢生芽的誘導(dǎo)效率、農(nóng)桿菌侵染效率等，進一步提高大豆再生效率和轉(zhuǎn)化效率，建立一種穩(wěn)定性好、轉(zhuǎn)化效率高的大豆遺傳轉(zhuǎn)化體系，為今后的大豆分子育種和基因功能研究打下了良好的基礎(chǔ)。結(jié)果表明:不